微生物指标及微生物检验.ppt

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1、生活饮用水卫生标准GB5749-2006生活饮用水标准检验方法GB5750-2006微生物指标及微生物检验的介绍广东省CDC微生物检验所 严纪文,我国旧的饮用水水质标准是1985年颁布实施的GB5749-85，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外的饮用水标准相比，主要差别在于微生物指标项目少，缺少有机物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。修订后的标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和隐孢子虫。同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆菌。,水质常规指标及限值,水质非常规指

2、标及限值,小型集中式供水和分散式供水部分水质指标及限值,生活饮用水水质参考指标及限值,一、菌落总数,二、总大肠菌群（埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属）除多管发酵法、滤膜法外，增加了酶底物检测方法多管发酵法,滤膜法,酶底物法酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生-半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。培养基：MMO-MUG培养基（Minimal Medium ONPG-MUG）。本方法可分为定性和定量。定量法：10管法、51孔定量法 培养条件：361 24h 能产生-半乳糖苷酶的细菌

3、群组分解ONPG使培养基呈黄色酶底物法的主要特点：优点：可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h无需确证试验操作简单，对试验条件和人员要求低缺点：检测成本高,总大肠菌群三种方法的比较,三、耐热大肠菌群（埃希氏菌属、耐热克雷伯氏菌）检测方法：多管发酵法、滤膜法,四、大肠埃希氏菌检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5培养24h产生-葡萄糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。培养基：

4、EC-MUG（4-甲基伞形酮-D-葡萄糖酫酸苷）。培养条件：44.50.5 培养242h。紫外灯：波长366nm，功率6W大肠杆菌能产生-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产生蓝色荧光滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜 在含有荧光底物的培养基上培养，能产生-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。培养基：NA-MUG培养条件：361 培养4h紫外灯：波长366nm，功率6W,酶底物法定义：在选择培养基上能产生-半乳糖苷酶分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生-葡萄糖酫酸酶分解

5、荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。培养基：ONPG-MUG结果判定：水样变黄色同时在366nm的紫外光下产生蓝色荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为阳性。,五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫 贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体内的肠道原虫，可致人兽共患病。患此病的人和动物从粪便中排出大量的卵(孢)囊污染环境，在地面水和防护差的地下水及处理不良的自来水中都可检出卵(孢)囊。随着社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在的危险因素加以限制很有必要。在此基础上，新标准中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法。,

6、Cryptosporidium 隐孢子虫特点:单一细胞原生动物，约3-7m。有微小隐孢子虫、鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内的主要为微小隐孢子虫（Cparvum）。宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染的动物体肠道内，卵囊通过粪便排出体外污染环境。易感人群：免疫缺陷者（如爱滋患者）、儿童、老人、医务人员等传播方式:以粪-口，手-口途径为主，污染的水源和空气均可传播。,Cryptosporidium 隐孢子虫生活周期,子孢子,滋养体,型裂殖体,裂殖子,型裂殖体,雌、雄配子体,合子,成熟卵囊,裂殖子,Cryptosporidium 隐孢子虫(染色后荧光

7、显微镜下),特点:单一细胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫 Giardia lamblia。在不同温度和纬度地区均能发现该病；发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高达到20-30%。可引起急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童的生长发育。传染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人带孢囊全家感染；传播:通过被污染的水和食物经口传播；接触（往往一人带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。易感人群：3岁以内婴儿；免疫功能受损害者；旅游者。,Giardia 贾第鞭毛虫,重要的动物宿主贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包括两栖动物；鸟类；哺乳动物在内的40多种动

8、物均可成为贾第鞭毛虫的宿主。调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠及大鼠等动物感染。一些生活在水中的动物可被来源于人的贾第鞭毛虫孢囊感染，因此这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾第鞭虫的传播媒介。,Giardia 贾第鞭毛虫,两虫感染的特点贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium)/感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素无效，治疗依赖于自身抵抗力大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大部分地下水都有被地表水污染的潜在危险可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化消毒有抗性,氯不能渗

9、透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能完全去除 饮用水高温煮沸也并非有效对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高,隐孢子虫感染案例,1993 年在美国威斯康星州的东南 部港口城市密尔沃基暴发 400,000 人被Cryptosporidium感染，4,000人到医院 就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎的饮用水。1996 年美国CDC将 Cryptosporidium感染列入国家必须申报的传染病名单，2002年将 Giardia 感染列入国家必须申报的传染病名单,两虫的检测方法（免疫磁分离荧光抗体法）检测程序：水样过滤 洗涤 离心 免疫磁珠捕获卵囊 磁珠与卵囊复合物的分离 荧光标记和DAPI

10、染色 显微镜检查记述 结果报告检测问题：方法操作复杂检出率低无法进行生物活性判定不能进行属、种鉴定价格高,IDEXX Filta-Max 手动/自动系统滤器及滤芯,FiltaMax Xpress 快速系统-滤器及滤芯,过滤器,滤芯,Filta-Max:滤芯结构（手动/自动法）,60 层环状海绵:55mm x 10mm(18mm 中孔)从60cm 压缩成 3cm螺栓固定,Filta-Max xpress:快速法滤芯结构,40 层海绵:55mm x 10mm(18mm 中孔)39层海绵:40mm x 10mm(18mm中孔)交互叠放从79cm 压缩到 3cm螺栓固定,1.水样过滤水样从两侧流经压缩

11、的海绵膜汇集至中孔“两虫”在滤芯表面被捕获,滤器连接套件,滤器,滤芯（过滤模块）,洗涤管,滤芯置于洗涤管,并将滤芯下部的压缩固定锣栓解除,周律性地压缩/扩展海绵滤芯,2.洗涤(淘洗)滤芯,洗涤(淘洗)装置,Filta-Max手动淘洗装置,Filta-Max自动淘洗装置,FiltaMax Xpress 快速淘洗装置,过滤器,500ml锥形离心瓶,Filta-Max xpress快速法淘洗流程,滤器（带滤芯）放入淘洗装置淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机加 4.0 巴(58 psi)压缩空气按动F1钮2分钟后收集400ml淘洗液快速全自动,滤器滤芯,淘洗液收集,1.将装有淘洗液样本的500mL离心管置

12、2000g离心力下，离心15min。慢慢地减速，（不能使用制动装置！）以免搅起沉淀物。2.用吸气装置将沉淀物上层8-10mL处的悬浮物小心吸出（吸气装置的真空应小于3.3kPa）。,3.离心浓缩,4.免疫磁珠捕获,捕获原理:,标记A抗体的磁珠,具有A抗原的C/G,DYNAL MIX 1混合器,MPC-1磁极,MPC-S磁极,5.免疫磁珠与孢（卵）囊复合物的分离,60min,5min,10min,染色镜检,6.染色及镜检,单克隆免疫荧光染色（FA-异硫氰酸荧光素）或 DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色荧光显微镜（Differential Interference Contrast,DI

13、C）,隐孢子虫,贾第鞭毛虫,两虫的单抗染色结果,隐孢子虫的单克隆抗体染色结果,隐孢子虫 DAPI 染色结果,贾第鞭毛虫的单克隆抗体染色结果,贾第鞭毛虫 DAPI 染色结果,贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊在荧光镜下的特征1.在镜下可见苹果绿色的孢（卵）囊。2.孢（卵）囊的形状、大小符合描述。3.膜与胞质的对照，膜的荧光要强一些。4.孢（卵）壁的完整性（孢囊可能会失去！）,7.结果的计算、报告和检测限每升水中的孢（卵）囊数计算公式：Y=（XV）/（V1V2）Y:每升水中的孢囊或卵囊的数目X：计数样本的体积中孢囊或卵囊的数目V：离心后再悬浮的体积，单位为mLV1：计数样本的体积，单位为mLV2：过滤后水的体积，单位为L计算分析的检出限:D=V/(V1V2)D:每升孢囊或卵囊的检测限V:离心后再悬浮的体积，单位为mLV1：计数样本的体积，单位为mLV2：过滤后水的体积，单位为L,两虫检测的质量控制:免疫荧光质量控制:针对免疫荧光试剂盒,由两个试验组成(阴、阳性对照）;1次/周。整个程序的质量控制：从采样 镜检（阴、阳性对照）。1次/三个月。两虫检测所需要最基本的设备：1.蠕动泵2.滤芯的淘洗装置3.高速离心机4.磁力混合器、磁极5.荧光显微镜,谢谢!,