微生物学实验三.ppt

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1、基础医学院微生物学教研室 屈艳,Tel：0373-3029130 E-mail：,实验三 抗酸染色病毒的接种与培养真菌菌落形态观察,一、实验目的1.掌握抗酸染色方法。2.了解抗酸染色的原理和意义。,抗 酸 染 色 Acid fast stain,分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用3%盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而

2、其他细菌及背景中的物质为兰色。,二、实验原理,细菌：卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美 兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片等,三、实验材料,1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热35min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。2）脱色：3%盐酸酒精脱色30s1min；用水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。,四、方法与步骤,五、实验结果,结核杆菌呈

3、红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。,六、注意事项,1、无菌操作2、染色时间3、初染加热的温度，勿沸腾,病毒的接种与培养真菌菌落形态观察,实验目的,了解病毒的培养方法掌握病毒的鸡胚接种及动物接种了解常见真菌的菌落特点,一.病毒的培养,病毒结构简单，缺乏完整的酶系统，不能在无生命的人工培养基中生长，必须在活的组织细胞中才能增殖。,1.动物接种（Animal inoculation）,最早应用的病毒培养法。用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。缺陷：带菌，缺敏感动物。常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静脉注射等。,常用动物接种分离的

4、病毒及接种途径,小白鼠的脑内接种,1、取病毒悬液：用0.25ml注射器取0.1ml病 毒悬液，去除注射器内的气泡。2、固定小白鼠：用左手大拇指和食指握住小白鼠的头部，手掌轻轻按住小白鼠的体部。3、消毒注射部位：右手用棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。,4、接种：右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向）注入，进入颅腔即可，（一般进针23mm）不要插得太深。5、观察：注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。,处死小白鼠-颈椎脱臼法,2.鸡胚接种,接种途径可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离流感

5、病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法,尿囊腔接种法卵黄囊接种法绒毛尿囊膜接种法羊膜囊接种法,常用鸡胚分离或鉴定的病毒,判断鸡胚是否存活,在检卵灯下观察能否看到清晰的血管；胚胎是否移动；若胚龄过长，则需观察其胎盘部分，胎盘部分变苍白说明胚胎死亡，正常时胎盘发暗，蛋白部分透亮。,判断鸡胚是否存活,气室,鸡胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵白,卵膜,鸡胚结构示意图,绒毛尿囊膜接种法,定位：将胎盘部分 及自然气室部分用记号 笔画出，在离开胎盘与大血管区画一直径约1cm的等边三角形,取卵壳：依次用碘酊，酒精消毒记号处，用锯片将标记三角区卵壳锯穿，（注意勿损伤卵壳下各层膜

6、组织），取下所画三角形区域的卵壳，（注意卵壳下各层膜组织），然后用针尖轻轻将暴露的卵膜中心刺破一个小口（不要伤及绒毛尿囊膜）。造人工气室：在自然气室部分消毒后用锥子或大注射器针头在气室正中钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一“人工气室”。,接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒0.10.2ml。封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。培养：放入温箱培育4天，然后收获病毒。,二.真菌菌落的观察（示教）,真菌培养营养要求不高，在一般培养基上能生长常用沙保弱（Sabouraud）培养基（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、琼脂、PH4.06.0），真菌的最适

7、酸碱度是PH4.06.0，最适生长温度浅部真菌2228 深部真菌37。,真菌菌落类型,酵母型菌落（yeast colony）菌落光滑、湿润。无菌丝隐球菌菌落类酵母型菌落（yeast-like colony）外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝白色念株菌菌落丝状型菌落（filamentous colony）菌落系由多细胞菌丝体所组成大多数丝状真菌或霉菌的菌落,新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，与一般细菌菌落相似。白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培养基内。,表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，且培养基常有皱裂。小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。,注意事项,消毒小白鼠时不要碰到眼睛注射时不要扎的太深以免扎到手磨卵壳及钻孔时力量要适中看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中,实验报告,简述抗酸染色原理、方法和结果。绘制抗酸染色油镜下观察图。,1.抗酸染色的原理是什么？有什么临床意义？2.常用的病毒分离培养的方法有哪些？,思考题,