微生物发酵技术在植物保护上的应用.ppt

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1、微生物发酵技术,目录,什么是发酵、酿造发酵工业的微生物技术发展史发酵工业的工程技术发展史发酵与酿造的研究对象微生物发酵工业所用菌种微生物发酵的基本特征,发酵的英文Fermentation是从拉丁语ferver即“翻腾”、“沸涌”、“发泡”而来；因为发酵有鼓泡和类似翻腾、沸涌的现象。如中国的黄酒、欧洲的beer就以起泡现象作为判断发酵进程的标志。根据以往的观念，人们通常把食品发酵作为整个发酵工业的分支。,发酵技术是生物技术中最早发展和应用的食品加工技术之一。许多传统的发酵食品，如酒、豆豉、甜酱、豆瓣酱、酸乳、面包、火腿、腌菜、腐乳以及干酪等。随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，现代发酵技术应运

2、而生。传统发酵技术与DNA重组技术、细胞(动物细胞和植物细胞)融合技术结合，已成为现代发酵技术及工程的主要特征。,广义利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其他代谢产物的过程。狭义厌氧微生物或兼性厌氧微生物在无氧条件下进行能量代谢并获得能量的一种方式。发酵工业：（巴斯德）经纯种培养和提炼精制获得的成分单纯、无风味要求的产品的生产过程叫发酵工业。如酒精、抗生素、柠檬酸、氨基酸、酶、维生素、某些色素等。,2、酿造(brewing)和酿造工业,酿造(brewing)：我国人们对对一些特定产品发酵生产的特殊称法，是未知的混合微生物区系参与的一种自然发酵。酿造工业：经自然培养、不需提炼

3、精制、产品由复杂成分构成并对风味有特殊要求的食品或调味品的生产过程。如黄酒、白酒、清酒、葡萄酒、酱油、醋、腐乳、豆豉、面酱等。,1676年列文虎克（Leewenhoch）18361837年Larkutzing18561857年Pasteur1870年Pasteur1880年科赫（Robert Koch）1897年，Buchner（布赫纳）1928年，Fleming1940年，Florery和Chain1945年，抗生素工业,二、发酵工业的微生物技术发展史,荷兰业余科学家，1676年，用自磨镜片创造了一架能放大 266倍的原始显微镜一生制作了419台显微镜；发表论文400余篇，375篇寄往英国皇

4、家学会发表。,Anthnoy van Leeuwenhoek与他的显微镜,Anthnoy van Leeuwenhoek1684年寄给皇家协会信的部分内容,1836-1837年Larkutzing发现在啤酒的发酵中存在活的生物体，但并未发现发酵与微生物的关系。,不同时期观察到的酵母菌细胞结构,彻底否定了自然发生说,证实发酵由微生物引起,巴斯德的功绩,免疫学预防接种,发明巴氏消毒法,巴 斯 德 的雁颈瓶实验,发酵是由微生物进行的一种化学变化，不同类型的发酵是由形态可以区别的各种特殊的微生物所引起的。1870年，Pasteur发现了微生物之间有相互抑制的作用。即拮抗作用。其间1804年，法国厨师阿

5、卑特（Appert）发明了瓶装罐头）,巴斯德发现免疫现象动物实验人体实验,科赫的功绩,证实炭疽病因 炭疽杆菌发现结核病原菌结核杆菌,科赫法则,发明培养基并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立,划线法获得单菌落,单菌落,结论,1880年，发现可以通过稀释把多种微生物分离开来，建立了单种微生物的分离和纯培养技术。建立了研究的微生物一系列方法，把早年在马铃薯块上的培养技术改为明胶平板（1881）和 琼脂平板（1882）显微镜技术：包括细菌鞭毛在内的许多染色方法、悬滴培养法以及显微摄影技术。利用平板分离方法找到并分离许多传染病的病源菌（炭疽、结核、链球、）1884年提出了科赫法则（Kochs ostu

6、lates）：病原微生物存在与病体而非健康体；可纯培养；纯培养物接种后染病；可重新分离再培养。,(Joseph Lister,18271912)首创用石炭酸喷洒手术室和煮沸手术用具以防术后感染，为防腐、消毒，以及无菌操作奠定了基础。,1897年，Buchner（布赫纳）阐明了发酵的化学本质。即发酵是由酶引起的一类化学反应。实验：酵母菌细胞用石英砂磨碎制成酵母汁（应用于医学）+白砂糖（防腐）意外发现发酵 这是无生物细胞体系发酵的最初例子。,1928年，Fleming发现了青霉素，开创了好气性发酵工程，建立了通风搅拌技术。,1928年，Fleming将其命名为：青霉素,霉菌菌落周围出现抑制萄葡球菌

7、生长的抑制现象,产黄青霉菌落,细菌生长抑制区域,正常细菌生长区域,-抗生素的发现,1940年，Florery和Chain：碘黄青霉基中得到了纯品青霉素，继而放线菌链霉素，金、土、卡那、红、新、庆大.等相继发现。1984年达9000多种。1945年，抗生素工业（发酵工业正式兴起）,H.F.C.Crick发现DNA双螺旋模型,分子生物学发展阶段（成熟期）,1956年，Watson 和 Crick发现DNA双螺旋结构，为微生物遗传学及育种技术的研究带来极大发展。,分子生物学发展阶段（成熟期）特点,微生物学成为十分热门的前沿基础学科微生物成为生物学研究中的最主要对象生物工程中，发酵工程是最成熟的应用技

8、术,氨基酸生产菌种,1956年，日本的士下祝郎利用发酵法制造出了Glu。至今22种氨基酸用发酵法生产，其中18种直接发酵，4种用酶转化法生产。,第一个转折点微生物纯种分离培养技术建立自然发酵时期：知其然而不知其所以然，如厌气性酒类，好气性醋。微生物纯种分离培养技术，开创了人为控制微生物时代，减少了腐败现象，实现了无菌操作；发明了简便的密封式发酵罐；人工控制条件，提高发酵效率，稳定产品质量。,20世纪40年代，由于二战暴发，刺激了抗生素发酵工业的兴起，成功建立起深层通气培养法及整套工艺，包括向发酵罐内通入大量无菌空气、通过搅拌使空气分布均匀、培养基的灭菌和无菌接种、通氧量、pH、培养物供给等均已

9、解决，刺激了有机酸、酶制剂、维生素、激素等的大规模生产。,以动态生物化学和遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，选育高产菌株，实现有选择地大量生产目的产物。该技术先在氨基酸生产上获得成功，而后在核苷酸、有机酸、抗生素等其它产品中得到应用。,发酵罐的大型化、多样化、连续化和自动化方面有了极大发展。发酵过程的基本参数包括T、Ph、罐压、溶O2、Eh、空气流量、泡沫、CO2含量等均可自动记录和控制。（在线测试探头等）发酵与酿造技术的第四个转折点,针对单纯发酵法的缺陷，利用发酵法生产前体，用化学合成法得到终产品或反之。如Amyno法生产酱油。发酵与酿造技术的第五个转折点,DNA重组技术大大推动了发酵与酿

10、造技术的发展细胞融合技术：基因体外重组与克隆的工程菌株构建生物反应器：反应罐等设备、昆虫躯体、动物细胞乳腺、植物细胞的根茎果实。,尽管如此，食品发酵与酿造仍然有许多难以解决的实际问题，例如许多工程方面的研究经验还不足，还没有归纳为系统的理论，许多产品的发酵过程中的问题尚难以解决，很多问题有待研究探讨。,1、按产业部门来分：酿酒工业传统酿造工业有机酸发酵工业酶制剂发酵工业：淀粉酶中95%以上为霉菌、细菌淀粉酶氨基酸发酵工业功能性食品生产工业：低聚糖、真菌多糖、红曲等食品添加剂生产工业：黄原胶、海藻糖菌体制造工业：单细胞蛋白、酵母等维生素发酵工业：Vc、VB2、VB12核苷酸发酵工业：ATP、IM

11、P、GMP,2、按产品性质来分：,代谢产物发酵：产品包括初级代谢产物、中间代谢产物、次级代谢产物。1、初级代谢产物：微生物生长不同阶段产生不同的代谢产物，对数生长期形成的产物往往是细胞自身生长所必需的，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、脂类、糖类等。2、次级代谢产物：微生物细胞生长进入稳定期，有些微生物合成的在对数生长期不能合成的特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。,微生物酶发酵 酶普遍存在于动物、植物和微生物中。因为微生物种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点，所以目前工业应用的酶大多来自微生物发酵微生物的转化发酵 微生物的转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合

12、物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、脱氨反应等。,微生物菌体发酵 是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵是比较传统的菌体发酵工业。新的菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共存的密环菌等药用菌。香菇、云芝）生物工程细胞的发酵 是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”，细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。此类发酵的产物多种多样，如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素等。,优良的微生物菌种是发酵工业的基础

13、和关键，微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为最多1.从微生物分类学的角度把所需菌种分为：细菌类如短杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等；酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、汉逊酵母和假丝酵母等；霉菌如黄曲霉、红曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放线菌如各种抗生素，链、庆大等。2.作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有以下特点：(1)具有稳定的遗传学特性。(2)微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求。(3)生长条件易于满足。(4)具有较高的各种酶活力。（5）对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。,五、微生物发酵工业所用菌种

14、,1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程。2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵。3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业。微生物发酵主要有以下几个特征：（1）反应条件温和。通常由于微生物的生理特性，要求温度为3040、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放线菌的发酵和pH值中性偏碱性如细菌的发酵。（2）无菌发酵，整个反应过程要求无菌。培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。（3）非连续性生产。微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性，大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是啤酒的连续化生产。,六、微生物发酵的基本

15、特征,微生物发酵技术的应用,医药工业（胰岛素、乙肝疫苗、干扰素）食品工业（饮料、酒类、氨基酸）能源工业（寻找新能源）化学工业冶金工业（分离、浓缩和提纯有用金属）农业（生物固氮、微生物农药、饲料等）环境保护（降解污染物）,第二节（一）工业发酵的工艺流程,生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵过程下游处理即分离提纯等几个过程。,找到合适的菌种是发酵工程的前提。人们最初是从自然界寻找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，使菌种产生

16、突变，以筛选出符合要求的优良菌种。随着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微生物所不能生产的产品。,一、菌种的选育,在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次扩大培养，让它们达到一定数量以后，再进行接种。,二、菌种培养基的配制,培养基是选择出的菌种生活的环境，对菌种有多方面的影响，所以至关重要。一般来说，培养基的配方要经过反复的实验才能确定。另外，发酵工程中所用的菌种多要求是纯培养的，即整个发酵过程不能混有杂菌，否则将导致产量大大下降，甚至得不到产品。例如，如果青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌会分泌青霉素酶，将形成的

17、青霉素分解掉。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。,三、扩大培养和接种,发酵过程一般是在发酵罐内进行的，发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升，罐上除有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置。发酵过程中环境条件的变化，不仅会影响菌种的生长繁殖，而且会影响菌种代谢产物的形成。为了使发酵过程能顺利进行，要随时取样，检测培养液中的细菌数目、产物浓度，同时还要及时为发酵菌提供必需的营养，并严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。,四、发酵过程,发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求

18、的产品。对发酵产品的要求不同，分离提纯的方法也相应有些区别。利用发酵工程生产的产品有菌种代谢产物和菌种本身（如酵母菌和细菌）两大类，如果产品是菌种，分离方法一般是通过过滤、沉淀从培养液中分离出；如果产品是代谢产物，则采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。分离提纯（层析分离等）后的产品，还要经过质量检查合格后，才能成为正式产品。,五、分离提纯,工艺流程,（二）发酵的操作方式,分批发酵：营养物和菌种一次性加入进行培养，直到结束放出，中间除空气进入和尾气排出，与外界没有物料交换。缺点：总生产力不高连续发酵：以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，使发酵罐内液量维持稳定，微生物

19、在稳定状态下生长。补料分批发酵：又称半连续发酵。是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。（生产效率最高）,（三）发酵工艺控制,为了能对发酵生产过程进行必要的控制，需对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。直接参数：可直接采用特定的传感器检测的参数，如温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、pH值、溶解氧基质浓度、营养物质浓度等；间接参数：需根据一些直接检测出来的参数，借助于电脑计算和特定的数学模型才能得到的参数，如细胞生长速率、产物合成速率和呼吸熵等。,（四）发酵过程中的检测,发酵过程中必须检测糖、氮、无机盐的消耗、pH值、排气组成。菌丝量和产物积累状况等，目的在于

20、控制这些参数，使之达到最佳水平，以便获得最大产量。,第三节 发酵技术在植物保护上的应用,杀虫微生物的发酵生产杀菌微生物的发酵生产除草微生物的选育和发酵生产,一、杀虫微生物的发酵生产,细菌杀虫剂 苏云金芽孢杆菌 伴孢晶体是苏云金芽孢杆菌赖以杀虫的主要毒素，又称-内毒素。它是一种蛋白质晶体，当敏感性昆虫吞食这种晶体后，在其碱性肠道中晶体被水解成毒性肽，产生毒性。幼虫表现为停止取食，麻痹，进而破坏中肠的上皮细胞，肠道内含物渗入血腔，pH下降，幼虫全身瘫痪，得败血症而死亡。,对伴孢晶体毒素敏感的昆虫种类主要有鳞翅目、双翅目和鞘翅目的部分昆虫的幼虫。苏云金杆菌的有些变种还能产生水溶性的-外毒素，又称热稳

21、定性外毒素，对很多目的昆虫有毒性。,苏云金芽孢杆菌的发酵生产,苏云金芽孢杆菌菌剂的生产常采用液体发酵或半固体发酵法。（自学）,真菌杀虫剂 杀虫真菌的种类很多，在发展成为生物杀虫剂的长期努力中，迄今已成为商品的仅有白僵菌和绿僵菌。白僵菌用于防治松毛虫、玉米螟效果好，尤其是用于防治松毛虫，白僵菌可作为环境因子，持续多年控制松毛虫的危害。,球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的菌丝长出金龟甲尸体表面,球孢白僵菌杀死松毛虫、蝗虫和家蚕,松毛虫,僵蚕(家蚕幼虫感染白僵菌而致死的干燥带菌虫体),性味和功用 辛、咸，平。归肺、肝、胃经。祛风解痉，化痰散结。用于肝风头痛眩晕，惊风抽搐，咽喉肿痛，

22、中风失音，喉痹，痰热结核，齿痛，瘰疬，风疮丹毒作痒。常用量510克。,其它微生物杀虫剂 昆虫病毒 原生动物杀虫剂,棉铃虫幼虫的环节处被核型多角体病毒感染.80%的昆虫病毒都是农林业中常见的鳞翅目害虫的病原体，因此是害虫生物防治的巨大资源库。,近20年来，利用昆虫病毒防治农作物害虫已成为国内外生物防治的一个重要发展方向。HaSNPV是棉铃虫特异性病原病毒，由武汉病毒所分离，自70年代起被用于棉铃虫的防治。在武汉病毒所和兄弟单位的协助之下，该病毒在1993年被登记注册为我国的第一个病毒杀虫剂，目前年产200400吨，年应用面积达 200万亩次，在国际上具有较大的影响。我国许多地方都开展了不同规模的

23、田间治虫试验，其中面积较大的有赤松毛虫质型多角体病毒（CPV），棉铃虫和油桐尺蠖核型多角体病毒（NPV）和菜粉蝶颗粒体病毒（GV）等病毒杀虫剂，而且取得了较好的防治效果。,（二）杀菌微生物的发酵生产,植物病原菌的活动经常受到来自其他微生物的抑制或干扰，其作用机制主要是拮抗、竞争、寄生、共生、诱导及交叉保护等。很多细菌和放线菌可以通过拮抗作用抑制病原物的生长，其中绝大多数都可产生抗生素或细菌素。,抗生素是指由生物在其生命活动过程中所产生的活性物质，这类物质能以极小的浓度选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞、抑制酶的活性、杀虫或刺激生物生长。细菌素是非复制性的抗细菌物质，是细菌合成的对其他微生物具有抗生作用的小分子质量蛋白质，这类物质对亲缘关系相近的细菌具有特异性的抑制效果。当细菌素与细菌结合并进入细菌细胞后，细菌素能以多种方式杀死其目标细胞，如扰乱蛋白质合成，破坏脱氧核糖核酸的稳定性等。,