微生物反应动力学.ppt
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1、微生物反应动力学,主讲:罗剑飞 学时:8,微生物反应动力学,概论细胞反应过程计量学分批培养动力学 1.细胞生长动力学 2.基质消耗动力学 3.产物生成动力学连续培养动力学,1、概论,1.1 微生物的分类 微生物(Microorganism)是对所有形体微小的单细胞,或细胞结构较为简单的多细胞,或没有细胞结构的低等生物的通称。不具细胞结构:病毒、类病毒、朊病毒原核微生物:细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、蓝细菌等;真核微生物:酵母菌、霉菌、担子菌、藻类等.,Carl Woese利用 rRNA建立分子进化树,分类单元及其等级,界(Kingdom),门(Phylum),纲(Class),目(
2、Order),科(Family),属(Genus),种(Species),根据Carl Woese的理论,现在还在界之上使用域(domain),把全部生物先分为古生菌域、细菌域和真核生物域;只有真核生物域下再分为原生生物界、真菌界、动物界和植物界。,1.2 微生物的化学组成 微生物菌体的80%左右是水分。湿菌体(wet cell mass)所含水分是指菌体在100前后干燥直到恒重时减少的量。除去水分的菌体称为干菌体(dry cell mass)。微生物菌体中除水分外,其余为蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸、维生素和无机物等化学物质。细胞中某些元素(除碳、氧、氮和氢外)的含量,一般以磷、钾为多,其
3、次是钙、镁、硫、钠、氯、铁、锌、硅等。另外,还含有微量的铝、铜、锰、钴等。,1.3 微生物的生长特性 由于微生物种类各异,不同微生物的生长特性亦有很大差别。细菌以分裂方式进行的繁殖。在适宜的生长条件下,某些细菌的世代时间可达1020min。然而,比较典型的世代时间为4060 min。当细菌分裂为二分裂时,世代时间等于倍增时间(菌体量增加一倍所需时间)。,酵母菌的生长方式有出芽繁殖、裂殖和芽裂(如同菌丝生长)三种。在最适条件下,酵母在45 min内就可以分裂,比较典型的分裂时间为90120 min。霉菌的生长特性是菌丝伸长和分枝。从菌丝体(顶端生长)的顶端细胞间形成隔膜进行生长,一旦形成一个细胞
4、,它就保持其完整性。霉菌的倍增时间可短至6090 min,但典型的霉菌倍增时间为48 h。,微生物的特点:个体小,比表面积大 吸收多,转化快 生长旺,繁殖快 适应强,变异快 分布广,种类多,1.4 微生物与发酵工业发酵过程 利用微生物作为动力,生产某种特定产物的生物化学过程。发酵产品 酿造食品,酒精饮料,有机酸,核苷酸,氨基酸类物质,酶制剂,抗生素,有机溶剂其它化工产品,营养和生长必需物质,生物制药。,1.5 微生物反应的主要特征反应主体是活的细胞,能调节自己以适应环境变化(有氧和无氧)细胞反应过程的本质是复杂的酶催化反应体系细胞反应与酶催化反应有明显的不同,细胞反应可再生,细胞不同生长阶段有
5、不同的催化活性,等 对细胞反应过程的量化分析,必须解决反应过程中涉及的各种物料和能量的数量比例关系及反应过程速率问题,前一个涉及的是反应计量学,后一个则是反应过程动力学。,1.6 微生物反应动力学研究目的 微生物工程的基本任务是高效地利用微生物所具有的内在生产力,以较低的能耗和物耗最大限度地生产生物产品,因此必须对微生物反应的整个过程实现有效的控制。微生物动力学为这一目的提供了部分理论依据。,1.7 微生物反应动力学研究内容 微生物反应动力学是研究生物反应速度的规律,即细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率的变化规律。,基质(碳源),细胞,产物,1.8 微生物反应动力学研究方法 用数学模型定
6、量地描述生物反应过程中细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率等因素变化,达到对反应过程有效控制。,微生物反应动力学,概论细胞反应过程计量学分批培养动力学 1.细胞生长动力学 2.基质消耗动力学 3.产物生成动力学连续培养动力学,2、细胞反应过程计量学,反应计量学是对反应物的组成和反应转化速度的数量化研究,它与反应热力学和动力学一起构成反应工程学的理论基础。根据反应计量学,可知反应过程中各反应组分组成的变化规律以及各反应之间的数量关系。,2.1 研究计量学的目的及计量学特点,碳源 能源、细胞材料,中间产物 丙酮酸,构成细胞材料 氨基酸、核苷酸等,细胞,代谢产物 乙醇、CO2,最低培养基时微生物
7、对碳源的利用,异化,(H),H2O,厌氧,好氧,细胞材料 氨基酸等,中间产物 丙酮酸,细胞,ATP ADP,代谢产物 乙醇、CO2,完全培养基时微生物对碳源的利用,碳源 能源,ATP ADP,异化,异化,C2O,计量的不确定性反应物 生成物(碳、氮、磷、(生物量、产物、硫等营养源及前体)副产物、能量)反应主体是活的生命,能调节自己以适应环境变化(有氧和无氧)代谢网络中包含上千个反应,机理复杂,常采用经验模型速率间不象酶反应存在简单关系,因此须研究反应计量学。(常用速率:细胞生长、底物(氧消耗、产物(CO2)生成反应物的不确定性、细胞的不确定性、生成物的不确定性.,2.2 细胞生长的测定和计量,
8、微生物生长的测定,通常是测群体的重量或细胞数,而不是测细胞个体的重量或大小。细胞生长的方法,可测定细胞数、细胞重量、细胞内含物等。,2.2.1 直接计数法培养计数法:在合适的培养基上用Petri dishes培养,数菌落数。时间要20 30 小时,计数为活细胞。CFU(Colony forming unit),膜过滤培养法 当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器,然后将将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。,2.2.1 直接计数法显微计数法:在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目,以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长。,2.2.1
9、直接计数法细胞干重:(g/L),DCW(Dry cell weight),离心 烘干 恒重;80,24小时;110,8小时。,2.2.1 直接计数法浊度法:常用波长 500 700nm,线性区为0.31 吸光率单位。例如:某细菌悬浮液在520nm测得光密度和干菌重的关系为:1.75OD相当于1mg/mL菌量。,2.2.2 间接方法细胞堆积容积测量法:用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积,由此间接表示细胞重量的生长 细胞组成分析法:测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等),间接地算出细胞重量的生长qPCR荧光原位杂交法FISH:,2.3 细胞反应的计量式和元素平衡,System:
10、Fixed Amount of Cell Material,x变化则计量系数改变,在发酵过程更常用得率概念。,微生物反应过程中的质量衡算:,碳源氮源氧菌体有机产物CO2H2O,为了表示出微生物反应过程中各物质和各组分之间的数量关系,最常用 的方法是对各元素进行原子衡算。如果碳源由C、H、O组成,氮源为NH3,细胞的分子式定义为CHxOyNz,忽略其他微量元素P,S和灰分等,此时用碳的定量关系式表示微生物反应的计量关系是可行的。,基于元素平衡分析速率间关系,C:1=c+d+fH:m+3b=c+xd+2eO:n+2a=c+yd+e+2fN:b=c+zd,6个待定计量系数,4个方程,自由度为2,已知
11、2计量系数即可求出其它系数。若无产物,则由两个速率即可确定其它速率,但不是任意的两个速率(可观测性)。由c可确定a和f的值从而可得出呼吸熵与细胞得率的关系,对发酵过程状态检测很有意义。,碳源氮源氧菌体有机产物CO2H2O,菌体的元素分析-酵母干物质中的元素百分组成,C3.92H6O2.03N0.61 近似为 C4H6O2N0.6,微生物细胞的元素组成可通过元素分析方法测定,例:葡萄糖为基质进行面包酵母(S.cerevisiae)培养,培养的反应式可用下式表达,求计量关系中的系数a,b,c,d.,2.4 细胞反应过程中的得率系数,细胞反应过程中两种速率之比,得率系数可用于对细胞反应过程中碳源等物
12、质生成细胞或其它产物的潜力进行定量评价,最常用的得率系数有对底物的细胞得率Yx/s,对碳的细胞得率Yc,对氧的细胞得率系数Yx/O等。,对底物的细胞得率Yx/s 消耗1g基质生成细胞的克数称为细胞得率或称生长得率(cell yield或 growth yield)。,同一菌种,同一培养基,好氧培养的Yx/s比厌氧培养的大得多。另外同一菌株在基本、合成和复合培养基中培养所得Yx/s大小顺序为复合培养基合成培养基基本培养基。,对碳的细胞得率YC 当基质为碳源,无论是好氧培养还是厌氧培养,碳源的一部分被同化 为细胞的组成成分,其余部分被异化分解为CO2和代谢产物。,理论得率:仅考虑细胞生长所消耗的基
13、质,例:葡萄糖为碳源,NH3为氮源,进行某种细菌的好氧培养,消耗的葡萄糖中有2/3的碳源转化为细胞中的碳。反应式为:,计算上述反应中的得率系数Y x/s和Y x/o,对能量的细胞得率YATP 细胞异化代谢过程中每生成1molATP所增加的细胞量。,大量研究发现,厌氧培养时,YATP与细胞、底物的种类无关,基本上为常数10.,对氧的细胞得率YX/O,对底物的产物得率YP/S,此外,,微生物反应动力学,概论细胞反应过程计量学分批培养动力学 1.细胞生长动力学 2.基质消耗动力学 3.产物生成动力学连续培养动力学,3、分批培养动力学,细胞反应过程包括细胞的生长、底物的消耗和代谢产物的生成,要定量描述
14、细胞反应过程的速率,细胞生长动力学是其核心。,System:Fixed Amount of Cell Material,45,非生命体系,生命体系,细胞消耗营养成分,将培养环境中的底物转化为产物。,细胞在生命活动中产生热量,与此同时,通过设置培养环境的温度控制细胞的生长或产物合成。,细胞生长、增殖和代谢产物的积累,使培养环境的流变学性质(固含量、粘度)发生改变,细胞与培养环境之间的机械相互作用趋于明显,对于动物细胞培养过程的影响尤为显著。,细胞的生长是一个复杂的生物化学过程(胞内胞外的物质交换、多相的反应体系、多种营养成分、多种代谢产物等),对这样一个复杂的体系进行精确地描述是不可能的,为了工
15、程上的应用,首先要进行合理的简化,在简化的基础上建立过程的物理模型,再据此推出其数学模型。,简化的内容主要有:动力学是对细胞群体行为的描述,而不是对单一细胞;不考虑细胞之间的差别,建立的模型为确定论模型,考虑细胞间的差别,建立的模型为概率论模型;考虑细胞内部结构,建立的模型为结构模型,不考虑细胞内部结构,建立的模型为非结构模型;细胞与培养液分离,建立的模型为分离化模型,细胞与培养液均一,建立的模型为均一化模型。,3.1 细胞反应动力学分类,细胞生长实际情况,复杂,应用困难,不考虑细胞差异,简化物质传递,是最理想的模型Monod方程,包括分室模型、代谢模型和基因重组细胞生长模型,应用很少,3.2
16、 细胞反应过程中的速率和比速率,速率(rate):单位时间内浓度、质量等的变化量 rS、rP、rX比速率(specific rate):单位质量细胞所引起的速率变化。、qS、qO2,比生长速率是菌体繁殖速率与培养基中菌体浓度之比,它与微生物的生命活动有联系,速率(rate)、比速率(specific rate)和细胞浓度(concentration)的关系,细胞生长比速率,底物消耗比速率,氧气消耗比速率,CO2生成比速率,反应热生成比速率,3.3 细胞生长动力学,1)初始期(t=0tL)3)对数/指数生长期(t=tL tC)4)减速期(t=tC tD)5)稳定期(t=tD tF)6)衰亡期(t
17、=tF te),分批培养:在封闭培养系统中,一次投料、一次接种、一次 收获的间歇培养方式。,延滞期,接种后,细胞的生长进入延滞期。这个期间是细胞的适应调整期,细胞在一个新的环境中生存,需要根据新环境的营养特点重新调整细胞体内的酶系及代谢过程,以使自身能适应新的环境并开始生长和繁殖。,延滞期长的危害生长缓慢,合成代谢产物时间长染菌风险如何缩短延滞期种子活化接种对数期的种子适当加大接种量优化培养基组成加入生长因子(微量元素、维生素),当培养基中含有多种碳源时,可能会有多个延滞期的出现。,当一种碳源被利用完后,细胞还需重新调整细胞体内的酶系和代谢途径以适应另一种碳源的利用,这需要一个调整的过程。,二
18、次生长,二次生长现象:大肠杆菌在含乳糖和葡萄糖的培养基中,优先利用葡萄糖,并只有当葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖,这就形成了在两个对数生长期中间的第二个生长停滞期。,腺苷酸环化酶,乳糖操纵子模型解释分解代谢物的阻遏机制,对/指数期,细胞数目和细胞内物质以相同速度增加,期间每个细胞的组成基本保持一致。可以通过测定细胞数量或细胞质量测定细胞的比生长速率。,倍增时间(td):细胞量增大一倍所需要的时间,代时,一些细菌的代时,菌名培养基培养温度 代时E.coli(大肠杆菌)肉汤 3717minE.coli 牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes(产气肠细菌)肉汤或牛奶 371618
19、E.aerogenes 组合 372944B.Cereus(蜡状芽孢杆菌)肉汤3018B.thermophilus(嗜热芽孢杆菌)肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳杆菌)牛奶376687Streptococcus lactis(乳酸链球菌)牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌)肉汤3723.5Azotobacter chroococcum(褐球固氮菌)葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis(结核分枝杆菌)组合3779293Nitrobacter agilis(活跃硝化
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