常用化学药品检验方法检验仪器的使用.ppt

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1、常用化学药品检验方法检验仪器的使用,化学药品检验室,内容：,高效液相色谱仪器（高效液相）色谱理论滴定分析法,高效液相色谱仪一、结构示意图.二、部件介绍一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。现在的仪器还一般配置有在线脱气机、自动进样器、柱温箱等。制备型HPLC仪还配备有自动馏分收集装置。,泵,恒压泵、恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。目前应用的基本上是柱塞往复泵。（单元泵、四元泵、高压二元泵）柱塞往复泵使用时的注意事项：1 防止固体微粒进入泵体造成磨损。2 流动相不应含有对泵体造成腐蚀的化学物质。3 泵空转也会磨损柱塞，防止流动相跑空。4

2、压力过高会使密封环变形，产生漏液。5 防止流动相中析出盐晶，应开启柱塞冲洗功能。,进样器,主要部件为定量环及六通阀。使用时应注意：1 样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损2 进样量应不大于定量环体积的50%3 每次分析结束后应冲洗进样阀，现在大部分进样器能自动实现此功能。部分自动进样器还能实现柱前衍生化等操作。（Agilent）,色谱柱,色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。使用色谱柱时应注意事项：1 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。2 应逐渐改变溶剂的组成，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。3 一般不能反冲，否则

3、会迅速降低柱效。4 使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。5 流动相应先脱气，避免气泡进入柱体。6 测试基质复杂的样品时，应用保护柱。7 定期用强溶剂冲洗色谱柱，清除驻留在柱内的杂质。8 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇后塞紧。,高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型（按固定相分子聚集状态和分离机制分）：分配色谱(液-液色谱)；吸附色谱(液-固色谱)；离子交换色谱；空间排阻色谱；亲和色谱等。一、液-液色谱（一）反相键合相色谱 化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 特点：不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱,1分离机制：分配+吸附,疏溶剂理论

4、 流动相与溶质排斥力越强，作用时间，k，组分tR流动相与溶质排斥力越弱，作用时间，k，组分tR2固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（十八烷基Octadecylsilyl，简称ODS）3流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性（RP）底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水（缓冲盐溶液）+甲醇，乙腈，THF,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分,（二）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力（有分配和吸附两种说法）2固定相：极性大的氰基

5、、氨基、二氨基、芳硝基等键合相3流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂 例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小），分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性，分析极性大物质、酚、羧酸、核苷酸、糖类、氨基酸等（也可用作反相固定相，氨基柱不能用于分离甾酮、还原糖）,二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法）1.特点：流动相为液体，固定相为吸附相。2.分离机制：Xm+nSa=Xa+nSm K=XaSmn/XmSan3.结论：显

6、然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大。4.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。,三.离子交换色谱法 1.分离机制；离子与离子之间的电荷吸引力 2.适用范围；凡能在溶剂中电离的物质一般均可用该法进行分离。3.交换：KX=-NR4+X-Cl-/-NR4+Cl-X-DX=-NR4+X-/X-=KX-NR4+Cl-/Cl-4.结论：a.分配系数D愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。b.亲合力高的，在柱中保留值就愈大。5.应用：a.分离离子或可离解的化合物。b.主要用于分

7、析有机酸、氨基酸、核酸、多肽等。,离子对色谱法 1.特点：分离效能高，分析速度快，操作简便.2.分离机制：又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。3.分离过程：X+水相+Y水相 X+Y水相 KXY=X+Y 有机相/X+水相 Y 水相 DX=X+Y 有机相/X+水相=KXY Y 水相 4.a.可用C18、C8等常用色谱柱；b.庚烷磺酸钠等离子对试剂价格贵.5.应用：解决了以往难分离混合物的分离问题.主要用于分析离子强度大的酸碱物质。（三聚氰胺）,离子对色谱分离过程示意图,四、离子色谱法

8、1.固定相:离子交换树脂，常用苯 乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨 架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季 铵基（阴离子交换树脂）。流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器，安培 主配件：抑制柱 2.流程图：fig3-2 3.分类 a.双柱型：化学抑制型离子色谱法；b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液；,4.分离机制（阴离子为例）被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。5.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸、多肽、核酸等均可用该法

9、分析。离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器，离子色谱用的泵是PEEK材料衬里的不锈钢泵。,药典品种应用离子色谱法：,阳离子交换柱山梨醇及制剂甘油果糖氯化钠注射液甘露醇及制剂利巴韦林及制剂盐酸二甲双胍及制剂苹果酸及制剂富马酸及制剂,阴离子交换柱肝素钠及制剂帕米磷酸二钠及制剂氯膦酸二钠及制剂硫酸软骨素钠及制剂,五、空间排阻色谱法 1.固定相：凝胶 2.机制：类似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子大小有关.3.分离示意图，fig3-3 a.排斥极限A点;b

10、.全渗透极限B点 相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将按相对分子质量降低的次序被洗脱.4.常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。,2010版药典二部采用常压凝胶色谱的品种,2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种,2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种,19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 m 的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 10 m 球形硅胶。90年代早期，粒径为 5 m 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含

11、有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。手性色谱柱的开发。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 m 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。,填料发展史,无定形硅胶和键合相硅胶示意图：,填料发展史,色谱法的应用：液相色谱常用检测器,光学检测器：紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射（通用型检测器）电化学检测器：极谱、库仑、安培电学检测器：电导、介电常数质谱检测器选择性检测器：灵敏度较高,2010版药典二部采

12、用检测器情况,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,优点：适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物，使用UV时灵敏度更低；无需衍生化而直接测定，避免了衍生带来的误差。可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等。适用于组分复杂样品的分析，可以进行梯度洗脱，基线平稳。通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用。对不同物质，ELSD相应因子的变化比其它检测器要小得多。对环境影响不灵敏，室温下即可操作。没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测。与LC-MS的色谱条件一致，可直接进行方法转换。,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,影响ELSD响应的因素载气流速、雾化器设计与温度、流动相的组成和流速等

13、影响雾化过程。被分析物的浓度和体积质量决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径。被分析物的折射指数、光源发出的光的强度和波长、光电倍增管的位置等影响散射光强度。光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率，反映为实验者所观测的峰面积。,2010版药典二部应用蒸发光散射检测器的品种,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,图 硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：65，分流模式）,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,图 硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：110，不分流模式）,蒸发光散射检测器应用要点：,谨慎使用，充分优化实验条件。企业质控人员和药检所人员均需要。漂移管温度的优化：温度对响应值的影

14、响无明显的规律性。最优温度为在流动相基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度。雾化气流速的优化：流速越大，响应值越低。最优气体流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值的最低气体流速。,色谱法的应用：示差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器,山梨醇山梨醇注射液甘露醇甘露醇注射液乳果糖口服溶液,葡甲胺麦芽糖乳糖倍他环糊精羟丙基倍他环糊精,色谱法的应用：电导检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。优点：对流动相流

15、速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)。广泛应用于离子色谱。主要用于检测水溶性无机和有机离子。,帕米膦酸二钠注射液注射用帕米膦酸二钠盐酸头孢吡肟注射用盐酸头孢吡肟,氯膦酸二钠氯膦酸二钠注射液氯膦酸二钠胶囊,几种检测器主要特性比较表,液相色谱法流动相1.重要性：GC载气仅三四种，要提高柱效选择性，主要改变固定相的性质；LC则不同，当固定相选定时，流动相的种类，配比能显著地影响分离效果，因此流动相的选择很重要。2.选择流动相应注意的因素3.溶剂的选择：a.依据：溶剂的极性是重要依据。b.溶剂极性顺序，水最大，正已烷最小。c.采用多元组合溶

16、剂系统作为流动相（底液和洗脱液）d.根据不同的方法选择合适的底液和洗脱液,具体操作时还应注意的事项,流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。开机后把要用到的管路进行purge（脱气）处理。增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过 0.5ml/min，反之亦然。否则易使柱床下塌。装柱时注意流向，接口处不要留有空隙产生气泡。样品液请注意滤过后进样，注意样品溶剂的挥发性。测定完毕请用（甲醇：水=10:90）冲柱1小时，再用（甲醇：水=90:10）冲柱30分钟，长时间不用应最后再冲15分钟纯甲醇。对于含碳量高、封尾充分的柱，特别注意应先用含510%甲醇的水冲洗，

17、再用甲醇冲洗。,重温一下学校里学过的色谱理论知识,色谱法中的主要参数和关系式分配系数Kp和容量因子K,（1）分配系数Kp：定温定压下物质在固定相和流动相中的浓度比。KPAs/Am（s固定相；m流动相）（2）容量因子K：分配系数与两相体积有关的参数，表示溶质A在两相中的质量比。K=mAs/mAm=KPVS/Vm 应为110,.5 两个组分能完全分开,（3）分离度色谱柱的总分离效能指标 定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比,式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是 色谱分离的动力学因素。从中得到：两溶质保

18、留时间相差越大，色谱峰越窄，分 离越好。,a:柱效因子：塔板数决定，n 越大，柱效越高分离的越好。(色谱柱),分离度与柱效能、选择性的关系,b：选择因子：tR()与tR（1）相差越大，r2,1越大，分的越好。(样品),C：容量因子：k大一些对分析有利;太大，tR长；柱容量合适,分的才好。(流动相)一般k,色谱法的基本理论,一、塔板理论,色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发

19、度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,一、塔板理论,塔板理论公式,H=L/n*n=5.54(tR/W h/2)2=16(tR/W)2,二、速率理论范第姆特方程 用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不完全合理，因为色谱柱内并没有塔板，当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的 n（塔板数）和 H（柱效）也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。,1956年，荷兰学者范第姆特（VanDeo

20、mter）提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（即：使 H 增大）影响的方程。此方程经简化后写为:,该式称为速率方程（范氏方程）。,u为流动相线速度cm.s-1，线速度=柱长/死时间,速率理论范第姆特方程,（1）提出了影响的三项因素：A涡流扩散项，B分子扩散项，C传质阻力项。（2）在流动相流速一定时，当、最小时，小，n 才最高，柱效高。当、最大时，大，n 才最小，柱效低。,（1）涡流扩散项A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,A2dpA与填充物的平

21、均直径dp的大小和填充不规则因子有关。减小：固定相颗粒应适当细小、填充要均匀。,待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,由于溶质区带前后存在着浓度差，因而产生纵向扩散使区带（色谱峰）扩宽。由于分子在液体中的扩散速率大约是在气体中的 1/105，所以该项对液相色谱来说很小，而对气相色谱则很重要。扩散的严重与否，关键是取决于流动相的线速度。,减小纵向扩散项u 采取措施（针对气相色谱）适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。B2Dg Dg 适当降低柱

22、温c。,（3）传质阻力项Cu,传质阻力系数 C 包括两部分，g+Cl两项组成 Cg 流动相传质阻力系数 组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。,g,Cl 固定相传质阻力系数 即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。,2,组分在固定相中扩散系数,固定液膜厚度,减小采取措施：采用粒度小的填充物；Dl越大越好，增加柱温是提高Dl的方法之一。,液相色谱条件的试验评价,基线柱效分离度峰的对称性（T、S、AS）结果的重复性（RSD）,系统适用性试验,系统适用性试验是在正式检测之前进行预

23、试验，对目前实验条件所产生的分离效果及测定结果进行评价，确认仪器状态及实验条件达到一定要求后才可进行有效的测定。如系统适用性试验达不到要求，应对条件进行调整使最终符合要求。药典正文给出的条件，在不改变性质的基础上可按具体实验情况作出适当的调整,以符合系统适用性试验的要求。代表性质的有：色谱柱的填体，流动相的成份，检测波长等。常作出调整的有：流速，流动相中水相与有机相的配比等。,测定精度的控制,1.仪器状态良好,通过检定/校准 a.基线 b.流速稳定性 c.最低检测限 d.结果重现性2.色谱柱状态良好3.流动相的配制 试药选用化学纯以上,最好是分析纯,水用重蒸馏水,有机溶剂选用符合色谱要求的试剂

24、，流动相用前经脱气处理。4.合理设定参数；5.符合系统适用性试验要求；6.溶液配制按容量分析要求,并注意溶液的稳定性；7.用外标法测定时仪器最好配有定量环或自动进样,没有配备的仪器最好选用内标法；8.适当的保留时间；9.其他 开头几份结果一般不要；对供试品色谱图不完全了解之前应先走一份时间较长的图谱；进行双份平行试验。,滴定分析法,滴定分析是化学分析中的一类重要的分析方法。此类分析方法是将一种已知浓度的液体即滴定溶液用滴定管加到被测物质的溶液中，直到所加滴定液和被测组分按化学计量反应完全为止。优点：精密度和准确度高，操作简便，至今仍是组分单一原料药含量测定的首选方法；快速经济、仪器简单。缺点：

25、专属性不足，对组分较多的制剂，需较繁琐的前处理，可损失一定的精密度和准确度。,滴定分析法,滴定分析应符合以下条件：-a、反应应朝一个方向完全进行（完全、99.9%）；-b、反应严格按化学计量式进行；-c、反应迅速，必要时通过加热或加催化剂等方法加速反应；-d、共存物不得干扰测定，或能用适当方法消除；-e、确定等当点的方法简单灵敏；-f、标化滴定液所用基准物质易得，且符合纯度高、组分恒定且与化学式符合、性质稳定（标化时无副反应）等。,滴定分析法分类,根据化学反应不同-分酸碱滴定、沉淀滴定、络合滴定、氧化还原滴定；按滴定方式-分直接滴定和剩余滴定（也称回滴定、间接滴定）。,滴定分析法操作注意事项,

26、滴定液消耗体积：若使用50ml滴定管，最好在3040ml范围内；用25ml滴定管，最好在2025ml范围内，减少读数引起得相对误差。如：滴定管体积读数误差一般认为是0.02ml，如果消耗滴定液体积为10ml，则其相对误差为0.02101000.2%；体积为20ml，其相对误差为0.1%。滴定速度：不可过快，每秒放出34滴为宜，即“成滴不成串”，过快液体来不及自管壁流下而致读数不准，滴定至近终点时，速度要更慢，悬挂在滴定管尖端的液滴必须与锥形瓶壁接触使之落下并用洗瓶冲洗锥形瓶壁。滴定管内壁应洁净：以不挂水珠为宜，用前用滴定液少许冲洗23次。,滴定分析法操作注意事项,仪器要求：所用容量仪器均应符合

27、计量要求，用于原料药含量、仲裁品种、边缘品种等测定时，应使用带校正值的容量仪器。其校正值与标示值之比的绝对值大于0.05%时，应在计算中采用校正值予以补偿。温度要求：对某些热膨胀系数大的滴定液如高氯酸滴定液，滴定温度与标化温度不一致时，如温度相差在10以下，高氯酸滴定液的浓度应进行必要的校正，温度相差超过10，应重新标定。滴定液浓度要求：F值应在0.951.05之间 F=实际浓度/理论浓度,滴定分析法计算,直接滴定法-原料：（空白）100 含量%=(T为滴定度）1000（1-干燥失重%）-片剂、胶囊等：（空白）W平均 100 含量%=标示量-液体制剂：（空白）100 含量%=V标示量,关于剩余

28、滴定 的计算,（F1V1-F2V2）T 100含量%=W从上式可以看出，剩余滴定中，需要用到两种准确标定的滴定液，较麻烦如做空白试验，第一种滴定液则无需准确标定，只要标定第二种滴定液。,例如：甘磷酰芥的含量测定：取本品约0.2g(W)精密称定精密加入硝酸银滴定液(0.1mol/L)15ml加硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.lmol/L)滴定,并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于19.61 mg的C12H24N305P。设：硝酸银滴定液(0.1mol/L)浓度的F值为F1，精密加入为V1ml 硫氰酸铵滴定液(0.1molol/L)浓度的F值为F2 样品消耗硫氰酸铵滴定液0.1mol/L为V2ml 空白消耗硫氰酸氨滴定液0.lmol/Ld为V3ml,关于剩余滴定 的计算,(F1V1-F2V2)-(F1V1-F2V3)T100含量%=W(F2V3-F2V2)T100=W F2(V3-V2)T100=W,谢谢大家！,