宋存江《微生物发酵工程》第4章微生物发酵过程.ppt

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1、第四章 微生物发酵过程(Microbial Fermentation-Process)一.微生物发酵的类型 二.种子扩大培养 三.发酵培养基 四.发酵过程中间分析 五.发酵终点的判断 六.主要技术经济指标,微生物发酵的不同类型,一.微生物发酵的类型,如：黑曲霉发酵生产柠檬酸；棒状杆菌的Glu发酵；地衣芽胞杆菌发酵生产聚谷氨酸等,如：乳酸杆菌的乳酸发酵；梭状芽孢杆菌的丙酮丁醉发酵等,空气,如，酵母厌氧产酒精；好氧积累菌体；,另外，细胞固定化，生物法处理废水，细菌采矿等等;,固定化细胞,Next page,Next page,发酵形式 优 点 缺 点 固体 投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，广

2、房面积大劳动强度 发酵 因地制宜，利用农副产品以及下脚料作为 大不易机械化操作。原料进行生产。液体 液体环境适合菌体生长和物质传递，发酵在均 投资大，设备要求严格，发酵 质条件下进行，便于控制，液体输送方便，易 动力消耗比较大 于机械化操作，产品易精制 设备占地少，容 量大，可自动控制，适合大规模生产。,固体发酵和液体发酵的区别,表面发酵和深层发酵 表面培养法 深层培养法放置曲盘需要更多的厂房 利用密闭的发酵罐 需要更多的劳动力 相反 利用抵押空气鼓风机 需要高压空气 动力消耗少 空压机、搅拌耗能 需要简单控制 需要精密控制 很少有污染问题 污染往往成为严重问题产品回收包括水溶、抽提、相同过滤

3、、离心、蒸发、沉淀 相同,发酵罐进行的间歇操作称为分批发酵。在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。分批发酵中菌体生长规律及生长参数的数学模型将在第七章已有详述。工艺变量随时间而变化是该发酵方式的主要特征。摇瓶培养也属分批发酵.分批发酵的主要设备是种子培养罐、主发酵罐、无菌供气系统和产物分离纯化系统。分批发酵的基本过程如图,1.分批发酵(Batch Fermentation),2.补料分批发酵(Fed-batch Fermentation)以某种方式定时向培养系统补加一定营养物质的发

4、酵方式称为补料分批发酵。它是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。定时补料的同时并不向外排放发酵液，所以使发酵系统不再封闭，且培养液体积随时间和物料流速而变化。由于营养底物缓慢补入，既满足微生物生长和产物合成的持续需要，又避免了由于底物基质过量所引起的各种调控反应。定时补充物料，可使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定的范围内，既保证了微生物生长，又不会产生不利影响，从而达到提高容量产率、产物浓度和得率的目的。补料技术可以采用少量多次、少次多量、流加或微机控制流加；整个发酵过程中不断地调节补料率，维持各项物质的供需平衡。根据补入物料的组成可将补料分批发酵分为完全补料发酵和半分批补料发酵。完全

5、补料发酵是补入成分完全的培养基。半分批补料发酵是仅补入一种或几种限制性营养成分。,3.连续发酵(Continuous Fermentation)连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。下图为典型的实验室连续发酵系统。,连续发酵的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。,4.固态发酵(Solid State Fermentation)固态发酵是指微生物在没有游离水或几乎没有游离水的较湿的固态培

6、养基上的发酵过程。固态的湿培养基一般根据成分不同控制含水量在40-80左右，无游离水流出。农村的堆肥、青饲料发酵和酿酒制曲，就是典型的固态发酵。特别是我国工艺历史悠久、国际著名的白酒生产都有自己独特的固态发酵工艺过程。由于固态发酵方式节能、环保，近来又得到了人们的青睐。如：以产朊假丝酵母（Candida utilis）、面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）和啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）为复合发酵菌种，以麸皮、大豆饼和少量脱毒棉籽饼为原料，经固态发酵法生产饲料蛋白添加剂得到快速发展。伴随着发酵工程机械化、自动化、化工技术和设备的改进

7、，在传统固态发酵的基础上发展到现在的固态发酵。,现代固态发酵和传统固态发酵的比较,固态发酵生物活性物质,固态发酵和液体发酵是微生物发酵的两大技术领域，各具特征，并存在着明显的区别。固态发酵投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，因地制宜地利用农副产品以及下脚料作为原料进行生产。液体发酵适合菌体生长和物质传递，发酵在均质条件下进行，便于控制，液体输送方便易于机械化操作，产品易精制同时，液体发酵设备占地少，容量大，可自动化控制，适合大规模生产，具有很大的优势。但是，如能解决好固态发酵的设备问题，固态发酵也将会发挥出更大的作用。,5.高密度发酵(High Cell Density Fermentati

8、on)微生物代谢产物的合成完全是靠菌体作为生产者来实现的。菌体量越多产物的产量也越大。因此，通过发酵工程实现高密度微生物细胞培养则是发酵的最终要求。采用一定的工艺技术实现了高密度发酵，它不仅使发酵液的菌体浓度比分批发酵提高了10倍以上，而且使菌体的生产能力也处于最佳状态，并能消除有害代谢物对菌体正常发酵的影响。高密度发酵较分批发酵有显著的技术优势。表15-4 列举了几种微生物的高密度发酵结果。,菌 种 基础培养基 发酵罐 补料方法 细胞干重(g/L)培养时间(h),大肠杆菌 葡萄糖矿物 搅拌罐 葡萄糖（甘油）140-150 30-40 盐或甘油矿物盐 非限制指数补料枯草杆菌 含葡萄糖的完全 搅

9、拌罐 补料分批培养 185 30培养基 补加葡萄糖调节pH毕氏酵母 葡萄糖，矿物盐 搅拌罐 补料分批培养，100 50-120补加甲醇,高细胞密度发酵成功的实例,高密度发酵生物反应器有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器等。日本人铃木等用搅拌陶瓷膜反应器系统实现乳酸杆菌高密度培养，其陶瓷过滤器可从发酵液中去除抑制生长的代谢副产物。日本人内野等采用内外两个圆筒的膜透析反应器，能连续去除抑制性代谢产物，始终保持菌体生长繁殖。补料技术常用于高密度发酵，对提高菌体密度效果明显。有人采用三阶段式流加葡萄糖，高密度培养大肠杆菌重组菌株（YK537

10、/pDH-B2m），菌体密度达到53 OD600，骨形成蛋白（BMP-2A）产量达到2.78g/L。但有些菌体高密度发酵菌体浓度较理论浓度尚有距离，仍需深入研究。,6.基因工程菌的发酵(Recombinant strain fermentation)分子生物学技术特别是重组DNA技术的快速发展，众多的基因工程产品相继问世。下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途。工程菌常以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、某些假单胞菌、酵母菌、哺乳动物细胞等作为外源基因受体，其发酵培养与普通菌种的好气培养没有本质的差异。基因工程菌通常采用二阶段发酵培养工艺，先在一定时间内提高菌体浓度，其后添加诱导物或改变培养温度

11、而诱导外源基因的产物表达，并以综合评价决定产物表达的最佳诱导条件。基因工程技术日臻成熟，所构建的工程菌已实现发酵生产，很多产品已投放市场。如：胰岛素、干扰素、生长激素、乙型肝炎疫苗、高产苏氨酸等。有的基因工程菌其产品产量已高于普通菌种。一种带有头孢菌素生物合成限制性扩环酶外源基因的工程菌，其头孢菌素C的产量比原有菌种提高了15%。,下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途,重组原核微生物生产的部分蛋白药物,1.现代发酵技术的特点:(1)发酵工程与化学工程更紧密的结合;(2)发展酶，细胞的固定化技术。(3)遗传工程技术的应用，使得定向育种真正成为可能(4)计算机等自控技术的应用，提高了整体

12、水平2.典型的发酵生产过程（见下页图）:(1)原料的予处理:淀粉质原料:a.酸解:原料(淀粉+水+HCL)-调浆-(加热)-糖化-冷却-中和,脱色-过虑除菌-糖液。b.酶解:原料(淀粉+水)-调浆-(加酶加热)-液化-降温-(加酶 加热)-糖化-糖液 糖蜜类原料:a.酵母生产:浓糖蜜(40Be0)-稀释至17-18Be0-酸化(pH3.9)-水解(0.1MPa,5min)-石灰乳调 pH(4.4-4.8)-静止24h-沉淀与上清-上清液中-加营养盐-灭菌 b.柠檬酸发酵:浓糖蜜(40Be0)-稀释1倍-加热(50-550C)-加浓H2SO4(1%)-加热(大于900C,10 min)-澄清-沉

13、淀-取上清液-稀释至含糖11%-加NH4NO3(0.15%)-灭菌,二.微生物发酵的一般过程,原料 原始菌种预处理（粉碎，水解，除杂）斜面种子（活化）（一级种子）配料 种子扩大培养（摇瓶或茄瓶）（二级种子）灭菌 种子罐（一级发酵）开放式、密闭式 发酵罐（二级发酵）半密闭式 控制发酵条件并进行发醇过程检查 过滤，离心、蒸馏，萃取 产品提取 沉淀、离交，结晶、千燥 质量检查 成品 一般发酵工艺的全过程简图,典型的分批微生物反应工艺流程图,(2)种子扩大培养:a.固体发酵:活化斜面-三角瓶-发酵原料 b.好气性液体发酵:活化斜面-摇瓶液体种子（或茄型瓶种子）-种子罐（1，2级)-发酵罐。c.厌气液体

14、发酵:静止培养法（以丙酮丁醇发酵为例）活化斜面-不同水平三角瓶的逐级培养(20mL-100mL-500mL)-6 L 卡氏瓶-200L卡氏罐-5000L发酵罐(3)基本操作方式:a.分批操作(间歇操作):b.半分批操作(流加法),反复半分批操作(反复流加法):c.连续操作:(4)产品的分离提取（后处理）:a.酵母生产:发酵液-连续离心-板框过虑-干燥 b.味精生产:发酵液-离子交换-浓缩-结晶-洗涤-重结晶-干燥-筛分 c.酶制剂:发酵液-喷雾干燥(粗品)d.酒精与丙酮丁醇:醪液-蒸溜(粗,精)e.柠檬酸:发酵液-加热-板框过虑-CaCO3-中和-H2SO4-酸解,活性碳脱色-离子交换-浓缩-

15、结晶-干燥,三.发酵生产中的种子质量控制1.种子培养基和培养条件:种子培养基:能保证在生产中获得大量优质孢子或营养细胞，对于种子培 养基的要求:营养成分完整，丰富，氮源比例高;原料较精，总浓度较低;主要成分尽可能同发酵培养基一致；pH较稳定利于菌体正常生长和发育。培养条件:适当控制pH温度，通气和搅拌等条件，尽可能与发酵罐的起始条件相似。2.对接种物的一般要求:具有旺盛的增殖能力，达到较高的菌体浓度；纯度高，个体整齐，同步率高，生理活性强，无杂菌 性能稳定，不易变异，退化 质量判断:pH,菌体形态，菌体浓度，产物量，酶活性，培养液外观3.影响种子质量的因素:原材料质量；培养条件；温度；湿度；通

16、气量；斜面冷藏时间；培养基；pH值等。,4.种子质量的控制 种令，种子罐数，接种量；在种子生理状态和培养条件相同时 菌种稳定性检查；接种量越大发酵延滞期越短。杂菌检查；接种技术 5.决定种子扩大级数的因素 菌种的增殖速度；最低接种量;发酵规模；种子罐与发酵罐的容积比6.种子制备的放大原理与技术 种子扩大培养的主要目的：是为了获得大量的活力强的种子，以便在发酵罐的发酵培养过程中尽可能地缩短延迟期。延迟期的长短与种子的接种量、接种龄及其生理条件的影响。种子最好采用处于对数生长期的菌种。此时的微生物细胞具有较强的代谢活力。种龄对于能生成芽孢的种子尤为重要。（因为芽孢是在对数生长后期开始形成的，如接种

17、物中含有大量芽孢，则给随后的发酵带来较长的延迟期）。两个例子如下：枯草芽孢杆菌生产杆菌肽发酵时种子扩大培养的程序 梭状芽孢杆菌进行丙酮丁醇发酵时种子扩大培养的程序,枯草芽孢杆菌生产杆菌肽发酵时种子扩大培养的程序,级数 培养条件 培养时间 1 保藏菌种-4.0L摇瓶 18-24h 2 一级培养物-750L罐 6h 3 二级培养物-6000L罐 培养形成最大生物量 4 三级培养物-12000L罐 培养形成最大生物量,梭状芽孢杆菌进行丙酮丁醇发酵时种子扩大培养的程序,级数 培养条件 培养基 1 保藏菌种接种后培养24h 马铃薯葡萄糖肉汤 2 一级培养物-600mL 20-24h 糖4%，硫酸铵5%，

18、碳酸钙6%P2O5(以磷酸盐形式提供)3 90mL二级-含有3000mL液体锥形瓶 同二级 4 三级培养物-25000L罐 糖6%其余同二级 5 四级-300000 500000L罐 同四级，发酵中补充氨水 接种量 0.5 3%,四.发酵培养基1.概念；发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌浓，又要使长好的菌体迅速合成产物。2.发酵培养基的特点；1)要求发酵培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养；2)还要考虑适当的碳氮比，3)加缓冲剂稳定pH值；4)要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需要的元素、

19、前体和促进剂等。5)除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。6)若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。3.发酵培养基的组成 1）碳源 主要功能：为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的成分；为合成目的产物提供所需的碳素成分,2）氮源 有机氮源：豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等 无机氮源：铵盐、硝酸盐等 3）无机盐和微量元素 磷酸盐、硫酸镁、钾盐、微量元素 4）生长因子 微生物生长不可缺少的微量有机物质。包括维生素、氨基酸、嘌

20、呤嘧啶及其衍生物并非所有 微生物都必需，只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。5）前体（precursor）是在代谢产物合成过程中加入的直接或间接结合至产物分子中的小分子物质。有些 前体物质由菌体本身合成。如缬氨酸和半胱氨酸是青霉素的前体。6）诱导物（inducer）是促进某反应发生或者促进某基因转录的物质。有些半乳糖苷可使大肠杆菌-半乳 糖苷酶的产量增加1000倍，用甘露糖代替可阻遏碳源半乳糖，使有的菌株产生的纤维素酶增加1500倍 7）促进剂（promoter）是发酵过程中加入的能增进产物生成速率或促进产物得率的一些微量化学物质，一般与营养作用无关。促进剂促进产物

21、合成的机理是多方面的，包括影响酶活性，如Mg2+具有激活链 霉素、新霉素的激酶活性，二甲基亚砜有效刺激芽孢杆菌、曲霉属、酵母属等菌体的生长。4.培养基的设计和最优化 将在第五章中介绍响应面法,五.发酵过程中的中间分析 1.分析项目:发酵过程的分析项目包括物理指标、理化指标、化学指标和生物指标。物理指标包括温度、压力、体积、流量等。理化指标包括 pH、溶氧、溶CO2、氧化还原电位、气相成分分析等。化学测量项目包括基质浓度、前体浓度和产物浓度的变化等。生物生化项目包括生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分等。常见的发酵过程变量检测指标见表。,发酵过程变量检测指标（一）,发酵过程变量检测指标（二）,2.

22、发酵终点判断:生产率:kg/m3h;得率:kg产物/kg基质(转化率);发酵系数:kg产物/罐容积m3发酵周期 h3.放罐时间的确立考虑的因素:1)提高发酵生产率，降低成本，不影响产品取质量;2)放罐前的控制;3)发醇异常的处理 a）发酵液转稀:现象；粘度下降，泡沫上升，消沫效果减弱;原因:噬菌体侵染或其它未知因素；措施：适时补入适当碳源或氮源促使繁殖新菌体，恢复正常 b）发酵液过浓:原因：氮源过多，菌体过剩，溶解氧下降;措施:补入10%无菌水，使菌液浓度下降，粘度下降，改善发酵条件。c）耗糖缓慢:原因:种子质量，灭菌质量，磷盐浓度低。措施:补入适量合适的氮源，磷盐，提高发酵温度，风量；d）p

23、H不正常:原因:灭菌质量，原料质量，水质，通气，补料；措施：酸或碱调整。,菌体形态:种子阶段：掌握合适种令，确保优质种子；发酵阶段：观察生长是否正常，以便选择合适发酵条件如果发现不正常，则设法补救，及时发现杂菌污染，及早控制或处理。,六.主要技术经济指标 1.发酵率：表示发酵过程中化学及生化反应的动态变化，几种重要的物质变化速率。即：基质消耗、菌体生长和终点产物浓度改变的瞬时速率。2.发酵率的测定：发酵率的测定一般着重在菌体生长、基质利用和产物的形成三个方面，即发酵率是由“生长率”，“代谢率”和“生产率”组成。(1)生长率-以菌体生长代表各种酶的总催化活力(),g/gh(2)代谢率-表示菌体代

24、谢变化情况(Qc,Qs,QO2),g/gh(3)生产率-是以发酵时间除最后产物浓度之商，Qp g/gh 3.发酵率的表示 发酵率可以以体积为计量单位，表示浓度（单位体积的产物量）随时间变化速率，称为“体积率”，其单位是产物量/体积 时间。发酵率还可以菌体量作为单位，称为“比速率”，其单位为菌体量/单位菌体量 时间，用作发酵动力学分析。常见的具体技术经济指标有：（1）容量产率-单位时间内单位反应器的产物量(g产物/Lh)（2）转化率-单位底物产生的产物量(%)(kg产物/kg基质)（3）产物浓度-单位体积发酵液所含的产物量(g/L%),六.主要技术经济指标,发酵率(fermentation ra

25、te)表示发酵过程中化学及生化反应的动态变化，即表示几种重要物质的变化速率，也就是过程中基质的消耗、菌体生长和终点产物浓度改变的瞬时速率。发酵率是由生长率和代谢率(metabolism rate)以及生产率组成。生长率：是用菌体生长代表各种酶的总催化活力。测定菌体生长的方法虽然较多且较容易，但也只是酶活 力的一个粗略代表，用以估计发酵过程的推动力。代谢率：表示代谢变化的情况。菌体生长和产物合成都需要能量，一般以碳的利用率来代表能量释放的速 率，也可以通过测定各种氮源及代谢产物的变化来了解发酵过程的内在变化情况。生产率：是以发酵时间除最后产物浓度的商。体积率：发酵率可以以体积为计量单位，表示浓度

26、（单位体积的产物量）随时间的变化速率，称为体积率其单位是产物量/体积时间，因其中具有体积的涵义，故适用于设备设计的计算。发酵率还可以用菌体量作为单位，称为“比速率”，其单位为菌体量/单位菌体量时间，因系用酶催化的推动力求得，便于用作发酵动力学分析。生产力：企业报表中常有生产力的统计项目，是指单位发酵罐、单位时间的产量如20m3发酵罐的生产力，产量/20m3时间、该项目便于分析各企业之间的生产设备利用情况。,常用的具体技术经济指标包括：1.容量产率 即体积生产率(volume production rate)，定义为单位时间内单位容器容积的产物量，用 g 产物/Lh表示。它是发酵过程综合性能的度

27、量。2.得率（yield）得率是指单位底物所产生的菌体或产物量。此处底物多指用量最大的碳源物质。得率越高单位产品所消耗的原料量（得率的倒数）就越小。所以，提高得率是设计发酵工艺时所追求的主要目标之一。3.产物浓度 产物浓度是指单位体积发酵液中所含产物的重量或单位。容量产率、得率和产物浓度是相互关联的。提高培养基的底物浓度，会使最终的产物浓度提高。而只要没有使发酵周期过多地延长，容量产率也就会相应地有所提高。但是，如果某种底物的浓度提高，而其它营养物配合不当或刺激了分支代谢途径，产物得率有时会下降。所以，应针对发酵生产的实际情况，对三项技术指标统筹兼顾，设计出最优的发酵生产工艺。,思 考 题1.确立种子扩大培养的级数要考虑哪些因素？在种子扩大培养过程中应注意哪些问题？2.种子扩大培养过程中，实验室扩大培养方法和生产车间扩大培养的方法有何不同？3.种子培养基和发酵培养基的组成成分有什么不同？在设计上要考虑的因素分别是什么？4.影响生产菌种发挥其作用的因素有哪些？如何保证菌种的优良特性得到很好的发挥？5.如何确立发酵培养基的最佳组成和发酵的最佳条件？6.为什么不同产物的发酵接种量不同，如抗生素发酵接种量一般为7-7.5%，谷氨酸发酵的接种量为1%？,