宋存江《生物技术概论》2.基因工程-新.ppt

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1、2.基因工程,学习目的 学习基因工程基本原理和基本操作过程,为进一步学习生物技术相关知识和从事基因工程工作打下基础。,2.1 基因工程概况 2.1.1基因工程的基本含义 按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。,基因工程2 基因工程,2.1.2 基因工程的主要理论依据 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA)基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的

2、多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外)可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代,基因工程2.1 基因工程概况,2.1.3 基因工程研究的基本技术路线,基因工程2.1 基因工程概况,2.1.4 基因工程突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移,基因工程2.1 基因工程概况,2.2.1 DNA 2.2.1.1 DNA的组成和结构,基因工程2 基因工程,DNA由腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、

3、胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同，只是各自的碱基不同。,2.2 DNA重组,碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种。脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接。多个脱氧核苷酸按此方法连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5-磷酸基(5P)称为5端；另其一端为游离的3-羟基(3OH),称为3端。,基因工程2.2.1.1 DNA的组成和结构,基因工程2.2.1.1 DNA的组成和结构,DNA的双螺旋结构 DNA两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对和G与C互补配对的，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称

4、为双链DNA。少数病毒和噬菌体中的DNA是以单链形式存在的。,基因工程2.2.1.1 DNA的组成和结构,B-DNA双螺旋分子模型,基因工程2.2.1.1 DNA的组成和结构,2.2.1.2 DNA的功能（1）DNA分子能在细胞内复制 以原有的DNA链为模板，从特定的复制起始位点（ori）起始，复制出新的DNA链。（2）DNA是基因的主要携带者 一个基因是DNA分子上的一个特定的核苷酸序列。,基因工程2.2.1 DNA,基因工程2.2.1.2 DNA的功能,原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或-10区：-4-13bp之间由个核苷酸组成，多数是TATAAT序列。-35区：-

5、35bp前后保守的TTGACA序列。,动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列,基因工程2.2.1.2 DNA的功能,终止子发夹结构序列,基因工程2.2.1.2 DNA的功能,2.2.2 获得DNA片段的主要途径目的：（1）获得含有基因的DNA片段（2）获得含有基因表达调控因子的DNA片段（3）获得含有与基因重组有关的核苷酸序列的DNA片段主要途径：（1）限制性内切核酸酶酶切法（2）PCR扩增法（3）化学合成法,基因工程2.2 DNA重组,2.2.2.1 限制性内切核酸酶和DNA片段化 限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并

6、在合适的反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有3OH和5P的DNA片段。命名：HindIII由Haemophilus influenzae Rd中属名的H,种名的in 和菌株代号的d组成,III表示从此菌株中提取的第三种限制性内切核酸酶。识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。,基因工程2.2.2 获得DNA片段的主要途径,限制性内切核酸酶识别序列、酶切位点和酶切片段末端,基因工程2.2.2.1 限制性核酸内切酶和DNA片段化,粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3端比5端长的称为3粘性末端，5端比3端长的称为5粘

7、性末端。平末端：产生的DNA片段末端是平齐的。,限制性内切核酸酶的切割方法:单酶切法 双酶切法 完全酶切法 部分酶切方法,环状DNA酶切片段示意图,基因工程2.2.2.1 限制性核酸内切酶和DNA片段化,特异性DNA片段的PCR扩增特点：体外高效扩增特异DNA片段。一个待扩 增的DNA片段，在3h内可扩增出约106 个这样的DNA片段。关键因子：耐热性DNA聚合酶 引物,基因工程2.2.2 获得DNA片段的主要途径,反应过程：反应系统加热至9095,底物双链DNA变性成为两条单链DNA；降温至3760,使引物与模板DNA链互补序列杂交(复性)；升温至7075，耐热性DNA聚合酶催化引物按53方

8、向延伸,合成模板DNA链的互补链。重复以上过程，一般经过2530次循环片段。,基因工程特异性DNA片段的PCR扩增,基因工程特异性DNA片段的PCR扩增,PCR反应五要素,引物（软件设计）Taq酶（脱氧核糖核酸 polymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板 Mg2+,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR扩增特异性DNA片段过程,after 25 cycles,amplification=225 1 x 106 foldafter 45 cycles,amplification=245 3.5 x 1012 fold

9、,(2)耐热性DNA聚合酶在使靶DNA变性的高温下仍保持活性。(3)PCR引物引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，3端必须具备游离的-OH。(4)DNA片段PCR扩增系统,2.2.2.3 化学合成目的基因 根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列，采用DNA合成仪，将4种核苷酸单体按35磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。,基因工程2.2.2 获得DNA片段的主要途径,DNA合成仪,2.2.3 DNA片段的连接 2.2.3.1 DNA连接酶（DNA ligase）催化机理：催化双链DNA片段紧靠在一起的3OH末端与5 P末端之间形成磷酸二酯键，

10、使两末端连接。目前常用的连接酶：E.coli DNA 连接酶或T4 DNA 连接酶。,基因工程2.2 DNA重组,具互补粘性末端片段之间的连接,基因工程2.2.3 DNA片段的连接,2.2.3.2 DNA片段之间的连接,基因工程2.2.3.2 DNA片段之间的连接,具平末端DNA片段之间的连接,基因工程2.2.3.2 DNA片段之间的连接,DNA片段末端修饰后进行连接,DNA片段末端修饰后进行连接,基因工程2.2.3.2 DNA片段之间的连接,DNA片段脱磷酸化后连接,DNA片段末端修饰后进行连接,基因工程2.2.3.2 DNA片段之间的连接,DNA片段加连杆后或加衔接头连接,基因工程2.2.

11、3.2 DNA片段之间的连接,2.2.3.3 DNA重组类型 插入重组 置换重组,基因工程2.2.3 DNA片段的连接,3月21日,基因工程2 基因工程,基因克隆载体的含义 能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体（gene cloning vector）。,2.3 基因克隆载体,转基因研究中，单独一个基因或组成基因的某个元件，一般不易进入受体细胞，也不易在受体细胞内稳定维持。,基因克隆载体应具备的基本条件,(1)含有允许外源DNA片段组入的多克隆位点。(2)能携带外源基因进入受体细胞，或复制或整合。(3)具有合适的筛选标记 根据转化子抗药性进行筛选的a

12、mpr,根据转化子蓝白颜色进行筛选的lacZ,表达产物gfp等(4)克隆载体必须安全，不应含有对受体细胞有害基因，不会任意转入其他细胞。,利用-半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物(X-gal)和诱导物(1PTG)存在时，可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，-半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代，所产生的重组体丧失-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。,蓝白斑筛选,克隆载体种类按构建克隆载体的材料来源分:质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体.按克隆载体的

13、用途分:一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或U载体.,基因工程 2.3 基因克隆载体,按克隆载体的受体生物分:原核生物克隆载体 大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体 真核生物克隆载体 酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆载体、人克隆载体,基因工程2.3 基因克隆载体,克隆载体种类,含义：以质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。种类：大肠杆菌质粒载体 蓝藻穿梭质粒载体 农杆菌Ti质粒载体 酵母2m质粒载体.,2.3.1 质粒克隆载体,基因工程 2.3 基因克隆载体,质粒DNA,质粒载体,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一

14、类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中，一般以cccDNA的形式存在；绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。,基因工程 2.3.1 质粒克隆载体,(1)大肠杆菌质粒载体,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,pBR322简图,基因工程 2.3.1 质粒克隆载体,选择标记基因（抗药性基因）氨苄青霉素(Ap 或Amp)氯霉素(Cm或Cmp)卡那霉素(Kn 或Kan)四环素(Tc或Tet)链霉素(Sm 或Str),重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和

15、测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,基因工程2.3.1 质粒克隆载体,(2)蓝藻和大肠杆菌穿梭质粒载体,人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,(3)农杆菌Ti质粒载体,基因工程2.3.1 质粒克隆载体,(4)酵母2m质粒载体 存在于真核微生物酵母菌细胞核中但独立于染色体内的长度为2m并与组蛋白相结合的DNA质粒。,病毒（噬菌体）克隆载体,含义 以病毒（噬菌体）DNA或cDNA为主构建的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。种类 噬菌体克隆载体：噬菌体克隆载体 Cosmid载体 植物

16、病毒克隆载体：CaMV克隆载体 动物病毒克隆载体：痘苗病毒载体 腺病毒载体 反转录病毒克隆载体,2.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体,基因工程 2.3 基因克隆载体,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性：生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,I 噬菌体克隆载体,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因

17、,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,此末端称为cos位点,此末端称为cos位点,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质

18、，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,基因工程 2.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体,cosmid载体,cosmid载体是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,S

19、alI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为30-45 kb,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,cosmid载体,II 植物病毒克隆载体,烟草花叶病毒(TMV)克隆载体,III 动物病毒克隆载体,腺病毒克隆载体腺病毒(adenovirus,Ad)是一类无囊膜的20面体病毒，含有一个线性双链D

20、NA分子。Ad-DNA两端具有逆向末端重复序列IRT.在每一条单链DNA的5端共价结合一种特殊结合蛋白(5.5kD)TP,当DNA从病毒颗粒中释放后,通过该蛋白连接成环状。,基因工程 2.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体,2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体（1）含义：指能在宿主细胞中稳定地复制并准确 传递给子细胞的人工构建的染色体。（2）特点：能容纳长达 1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：构建基因组文库,克隆和转移完整的高分 子量基因,基因功能鉴定,基因治疗,基因工程 2.3 基因克隆载体,（4）类型：线形的人工染色体：必须含有端粒、着丝粒和 复制起始区。包含：酵母人工染

21、色体（YAC)人类人工染色体（HAC)哺乳动物人工染色体（MAC)环形的人工染色体：不需要端粒和着丝粒，但必须 含有合适的复制起始区。包含：细菌人工染色体(BAC)源于噬菌体1的人工染色体(PAC)双元细菌人工染色体(BIBAC)可转化人工染色体(TAC),基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,人工染色体载体,细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,

22、克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,人工染色体载体,酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350-40

23、0 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,构建人类人工染色体的基本策略,HAC,人工染色体的某些性质表,体内同源重组整合载体(系统),原理：两个不同的DNA分子在同源序列处发生重组，将各自携带的处于同源序列内的遗传信息互相交换。系统包括：整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区域，是外源DNA的定位整合位

24、置。定为整合载体：除了一般质粒载体应有的元件外，还必须含有一或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段。,2.3.4.1 常规基因整合平台系统 内源平台双交换置换载体内源平台双交换插入载体内源平台单交换插入载体外源平台双交换插入载体,基因工程 2.3.4.1 常规基因整合平台系统,基因工程 2.3.4.1 常规基因整合平台系统,基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统,位点特异性 重组，即体内发生的两条DNA特异位点上的同源重组，发生时需一段同源序列（特异性位点）和位点特异性的重组酶参与。Cre/lox定位重组系统包括特异性重组位点loxP和催化重组反应的特异性重组酶Cre。重组中，基于lo

25、xP位点的多少、所处的位置和排列的方向不同，在重组反应过程中会出现多种重组方式。,近年来建立了体内位点特异性重组，即体内发生的两条DNA特异位点上的同源重组，避免上述常规基因定位整合系统存在的问题。,loxP位点序列示意图,2.3.4.2 基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统,基因工程 2.3.4 体内同源重组整合载体（系统）,基因工程 2.3.4.2 基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统,2.4.1 目的基因来源,目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。目的基因的生物来源:真核生物染色体基因组 原核生物染色体基因组 质粒基因组

26、病毒（噬菌体）基因组 线粒体基因组 叶绿体基因组,基因工程2 基因工程,2.4 获得目的基因,分离目的基因的途径,酶切直接分离法PCR扩增法化学合成法构建基因组文库或cDNA文库分离法,基因工程2.4 获得目的基因,2.4.2.1 利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因,基因工程2.4 获得目的基因,PCR扩增含目的基因DNA示意,基因工程2.4.2 分离目的基因的途径,2.4.2.2 利用PCR直接扩增目的基因,基因工程2.4.2 分离目的基因的途径,2.4.2.3 目的基因的化学合成,构建基因组文库或cDNA文库分离的基因,基因组文库把某种生物基因组的全部遗传信息通过通过克隆载体贮存在

27、一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库经验公式：N=ln(1-P)/ln(1-f)N:基因组文库必须的克隆子数 P:文库中目的基因出现的概率 f:克隆DNA片段的平均大小与基因组大小的比值,构建基因组文库或cDNA文库分离法,cDNA文库以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。,基因工程2.4.2 分离目的基因的途径,从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因,根据目的基因已知核苷酸序列制

28、备核酸探针，进行筛选分离根据目的基因特异性表达进行分离,基因组文库 cDNA文库,信息供体 DNA mRNA,载体 噬菌体，黏粒，人工染色体 质粒，噬菌体,连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成cDNA双链,连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头,筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针,基因组文库和cDNA文库的比较,基因工程2.4.2.4 通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因,受体细胞 2.5.1.1 原核生物 种类：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌、棒状杆菌、放线菌等,基因工程2 基因工程,2.5 目的基因导入受体细胞,重组DNA分子能否有效地进入受体细胞，除了选用合适的克隆载体外，

29、还取决于选用的受体细胞和转移方法。受体细胞(receptor cell)又称宿主细胞或寄主细胞(host cell),可作为受体细胞的原则,便于重组DNA分子导入和筛选便于重组DNA分子稳定存在于细胞中适于外源基因的高效表达遗传稳定性高，密码子无明显偏爱性易于扩大培养与发酵安全性高，无致病性,一.原核生物细胞,作为受体细胞的优点:(1)不具纤维素壁(2)无核膜(3)基因组简单，便于遗 传分析(4)单细胞,作为受体细胞的不足:(1)不具真核蛋白折叠系统(2)不具真核蛋白加工系统(3)蛋白酶降解异源蛋白,目前作为受体菌的原核生物有:(1)大肠杆菌 革兰氏阴性菌 a.基因组、遗传背景了解最清楚 b.

30、易培养、繁殖迅速,(2)枯草杆菌 革兰氏阳性菌 a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物 分泌到培养基；b.无内毒素；c.易于保存与培养。,(3)蓝细菌 a.光能自养型，易于培养；b.与植物密码子和启动子的通用性，易于表达植物基因,特点：大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入;没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦;基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单,繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。,基因工程2.

31、5.1.1 原核生物,2.5.1.2 真核生物特点：真核生物细胞具备真核基因表达调控以及表达产物加工和分泌等的机制，因此作为受体细胞表达真核 基因优于原核生物细胞。低等真核生物，具有真核生物基因结构表达调控体系，具有真核的蛋白折叠、加工与分泌系统,基因工程受体细胞,真核细胞模式图,酵母菌 a.结构最简单的真核生物，遗传背景较为清楚 b.易培养 c.可分泌 d.不含毒素,植物细胞,具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁原生质体转化(纤维素酶处理)基因枪或农杆菌直接转化植物细胞的突出优点:细胞具有全能性,动物细胞 多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近 年用体细胞培养 常用的动物细胞受体:小鼠L细胞、Hel

32、a细胞、猴肾细胞、中国 仓鼠卵巢细胞(CHO)等,动物细胞的优点：可识别并除去内含子，加工成成熟mRNAb.翻译后加工，产物具有较好的免疫原性c.易感染，遗传稳定d.可分泌表达产物缺点：组织培养技术要求较高，周期长，难度大,种类：酵母：基因结构相对比较简单，便于基因工程操作；培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉；外源基因表达产物能分泌到培养基中,便于产物的提取和加工；不含特异性的病毒，不产生毒素，是安全的受体细胞。植物细胞：具全能性。有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草和拟南芥等。动物细胞：目前多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞以及干细胞。有猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等。,基因工程2.5.1.2 真

33、核生物,课程论文介绍,生物技术概论课程论文参考题目：,1.生物技术对人类进步、经济社会发展具有重要意义2 基因克隆载体的研究进展3 重组子鉴定、基因工程应用)4 细胞工程研究现状（植物或动物或微生物细胞工程）5.抗生素的利与弊6.中国酒类发酵的过去、现在和将来7（某发酵产品）的研究进展8.生物酶工程进展9.生物酶的固定化10.生物酶在生物传感器领域的应用）11.蛋白质工程的发展历程12.生物技术与农业13.生物技术与种植业、14.现代生物技术与养殖业、15.生物农药,生物技术与食品生物技术与食品生产生物技术与食品检测、转基因食品检测生物技术与人类健康生物技术与疫苗生物技术与疾病诊断生物技术与生

34、物制药生物技术与生物疗法生物技术与能源微生物与采油生物乙醇植物石油甲烷与燃料源燃料电池,生物氢生物技术与环境污水处理大气净化固废处理环境生物修复污染监测与评价生物技术的安全性及其影响微生物技术转基因食品动物克隆生物武器,参考文献要求：每组需参考文献十篇以上。字数：4000字以上。,3月28日,2.5.2 重组DNA分子导入受体细胞,基因工程2 基因工程,2.5 目的基因导入受体细胞,重组DNA分子能否有效地进入受体细胞，除了选用合适的克隆载体外，还取决于选用的受体细胞和转移方法。受体细胞(receptor cell)又称宿主细胞或寄主细胞(host cell)可作为受体细胞的原则 便于重组DN

35、A分子导入和筛选 便于重组DNA分子稳定存在于细胞中 适于外源基因的高效表达 遗传稳定性高，密码子无明显偏爱性 易于扩大培养与发酵 安全性高，无致病性,2.5.2.1 外源DNA转化方法化合物诱导转化法 根癌农杆菌介导转化法 电穿孔转化法 微弹轰击(基因枪)转化法激光微束穿孔转化法 超声波处理转化法脂质体介导转化法 体内注射转化法花粉管通道转化法 精子介导法低能离子束介导转化法,基因工程2.5.2.1 外源DNA转化方法,电穿孔仪,电转化仪,重组DNA分子导入受体细胞,转化(transformation)重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程。,化合物诱导转化法,制备感

36、受态细胞 二价阳离子（如Ca2+）处理受体细胞，可 以使其成为感受态细胞，即处于能摄取外 源DNA分子的生理状态的细胞；DNA分子转化感受态细胞 感受态细胞加入DNA分子 42C水浴上放置45秒(热激)会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里。,CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态可能的原因:Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内 外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态；Ca2+能与DNA分子结合，使DNA与Ca2+复合物接近细胞膜，当42C热激处理 时，膜出现间隙，DNA分子进入。,用氯化钙化学转化,电穿孔转化法,1988年，Dower等人转化大肠杆菌基本原理:高压电脉冲导致电穿孔(electropor

37、ation),体内注射转化法,2.5.2.2 病毒(噬菌体)颗粒转导法 用病毒(噬菌体)的 DNA（或cDNA）构建成重组DNA，在体外包装成重组病毒(噬菌体)颗粒，通过感染使重组DNA进入受体细胞。,基因工程2.5.2 重组DNA分子导入受体细胞,方式：重组病毒直接感染受体细胞重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞重组病毒感染互补型受体细胞系适用：主要用于基因组文库或cDNA文库 的构建和动植物的转基因。,基因工程2.5.2.2 病毒(噬菌体)颗粒转导法,基因工程2.5.2.2 病毒(噬菌体)颗粒转导法,克隆子的筛选,克隆子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为转化子，含有重组DNA分

38、子的转化子为克隆子筛选(screening)选择(selection),2.5.3 克隆子的筛选2.5.3.1 根据载体标记基因筛选转化子根据载体抗菌素抗性基因筛选转化子根据载体除草剂抗性基因筛选转化子根据LacZ基因互补显色筛选转化子根据生长调节剂非依赖型筛选转化子根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛 选转化子,基因工程2.5 目的基因导入受体细胞,氨苄青霉素(Ap 或Amp)氯霉素(Cm或Cmp)卡那霉素(Kn 或Kan)四环素(Tc或Tet)链霉素(Sm 或Str),(1)抗药性标志筛选,抗性平板,(2)根据载体除草剂抗性基因 和相应的选择药物筛选转化子,由于植物细胞对多数抗生素不敏感

39、，所以常用抗除草剂的基因作为选择标记基因。,-互补筛选（蓝-白筛选）,(3)lacZ基因显色互补筛选法,-互补筛选（蓝-白筛选）,-互补-半乳糖苷酶基因(LacZ)载体(含LacZ)LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息，编码-互补肽宿主菌 编码的缺陷型-半乳糖苷酶 肽段,lacZ基因显色互补筛选法,-半乳糖苷酶可在诱导剂IPTG存在的情况下，使底物X-gal转变为蓝色产物，使细菌克隆或噬斑呈蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后，便不能表达片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落或噬斑呈现白色。因此，-互补筛选又称蓝-白筛选。,载体上有-半乳糖苷酶N端编码序列，细菌染色体

40、DNA有-半乳糖苷酶C端编码序列,（蓝-白筛选）,(4)根据生长调节剂非依赖型筛选转化子,该标记基因产物是激素合成所必须酶类在培养基中不添加外源激素的情况下，只有转化子才能生长。常用于筛选植物转化子。,(5)根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子,这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。主要用于筛选动物转化子。,2.利用报告基因筛选植物转化细胞 选择标记基因(selective gene)报告基因(reporter gene)利用选择压力，将转基因受体细胞筛选出来；表达报告基因或与某基因做成嵌合基因，表达 融合蛋白，从报告基因的表达情

41、况了解目的基因 的表达情况及推测基因调控序列。,-葡萄糖酸苷酶基因(gus)萤火虫荧光素酶基因（luc）绿色荧光蛋白基因（gfp）,3.根据形成噬菌斑 筛选 噬菌体有效包装为：外源DNA插入，重组DNA分子的大小必须在野生型DNA长度的75%-105%范围内。外源DNA与DNA载体重组处理后，只有重组DNA分子才能体外包装和转导受体菌，在培养基上形成噬菌斑，并且未转导的受体均继续正常生长。,2.6.1 根据重组DNA分子特征鉴定重组子 2.6.1.1 根据重组DNA分子大小鉴定重组子 2.6.1.2 根据重组DNA分子酶切图谱鉴定重 组子 2.6.1.3 根据PCR扩增片段鉴定重组子,基因工程

42、2 基因工程,2.6 重组子的鉴定,获得转化子后，还需分析以下项目：重组DNA片段目的基因转录的mRNA或翻译的多肽（蛋白质、酶）,根据重组DNA分子特征鉴定,(1)分子大小,A,B,(2)限制性核酸内切酶分析法,根据重组DNA分子特征鉴定,(3)利用PCR扩增片段筛选重组子,根据重组DNA分子特征鉴定,(4)核酸分子杂交检测法 核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适 宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配 对原则特异性地复性，形成双链。,探针(已知核酸片断，单链),待测核苷酸序列(单链),根据重组DNA分子特征鉴定,2.6.1.4 采用DNA分子杂交法鉴定重组子S

43、outhern 印迹杂交斑点印迹杂交菌落（或噬菌斑）原位杂交,基因工程根据重组DNA分子鉴定重组子,基因工程2.6.1.4 采用DNA分子杂交法鉴定重组子,Southern印迹杂交 1975年，E.Southern 首先建立 针对于DNA的杂交技术，又称DNA印迹杂交,根据重组DNA分子特征鉴定,Southern 印迹杂交,基因工程2.6.1.4 采用DNA分子杂交法鉴定重组子,用限制性酶切DNA,琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹杂交的基本步骤DNA转膜,双链DNA碱变性,单链DNA,硝酸纤维素膜或尼龙膜,转膜,电转移,虹吸作用,菌落（或噬菌斑）原位杂交,基因工程2.6.1.4 采用DNA

44、分子杂交法鉴定重组子,2.菌落(或噬菌体)原位杂交 1975年，M.Grunstein和D.Hosness提出菌落原位杂交 1977年，W.D.Benton和R.W.Davis噬菌斑原位杂交 不必分离细菌或噬菌体DNA,经溶菌和变性处理 后，使DNA暴露出来并于滤膜结合,硝酸纤维膜,变性，用探针杂交，成像,3.核酸杂交的探针(1)常用探针类型：同源或部分同源 19-24bp 总cDNA探针 特异cDNA探针 人工合成寡核苷酸探针,(2)探针标记物 放射性标记物 32P 高放射性 半衰期14.3 d 35S 放射性较弱 半衰期87.1 d 3H 放射性弱 半衰期12.35 a 非放射性标记物 生

45、物素(biotin)地高辛(digoxigenin),根据重组DNA分子特征鉴定,(5)应用DNA芯片鉴定重组子DNA芯片利用反向杂交原理，使固定化的探针阵列与样品杂交，通过荧光扫描和计算机分析，获得样品中大量基因及表达信息。DNA芯片由载体、连接层和DNA分子探针阵列三部分构成。,基因工程根据重组DNA分子鉴定重组子,2.6.1.5 应用芯片鉴定重组子,基因工程根据重组DNA分子鉴定重组子,2.6.1.6 根据DNA序列鉴定重组子,2.6.2 根据外源基因转录产物mRNA鉴定重组子,根据RT-PCR 扩增片段鉴定重组子 采用RNA分子杂交法鉴定重组子 Northern印迹杂交法 斑点印迹杂交

46、 菌落（或噬菌斑）原位杂交,基因工程2.6 重组子的鉴定,(1)Northern印迹杂交 针对于RNA的杂交技术 步骤与Southern印迹杂交基本相似,根据目的基因转录产物mRNA鉴定,与Southern印迹杂交不同之处：RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解,变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境,根据目的基因转录产物mRNA鉴定,(2)RT-PCR从转化子中提取总RNA，以它为模板进行反转录，再进行PCR扩增。若获得了特异的cDNA片段则证明是含有外源基因的重组子。,2.6.3 根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多 肽鉴定重组子,蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子

47、单向凝胶电泳 双向凝胶电泳 毛细管等电点凝胶电泳免疫检测法鉴定重组子 酶联免疫吸附法 Western印迹法 固相放射免疫法 免疫沉淀法质谱分析法,基因工程2.6 重组子的鉴定,酶标仪,根据目的基因翻译产物鉴定,(1)蛋白凝胶电泳法,基因工程2.6.3 根据外源基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子,基因工程2.6.3 根据外源基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子,（2）免疫学检测,1.免疫沉淀步骤靶细胞放射性标记细胞裂解形成免疫复合物，A蛋白-sepharose回收靶蛋白的免疫沉淀电泳，放射自显影,酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（ELISA）是固-液、抗原-抗体反应体系，是通过酶反应检测抗

48、体与抗原结合的方法。由于酶催化反应具有放大作用，使得测定的灵敏度大大提高。,酶：辣根过氧物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）抗体制备抗体或抗原的包被免疫反应显色反应,ELISA,（3）Western 杂交,提取总蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白印迹探针制备杂交和检测,通过免疫反应筛选,在培养基上培养菌落,转膜,菌落印在膜上,杂交,菌落的蛋白产量露出来,加一抗,一抗与裸露一蛋白质结合,洗去游离的一抗，加显色剂,显色,找出阳性克隆,2.7.1基因工程的应用 基因工程药物 转基因植物 转基因动物,基因工程2 基因工程,2.7 基因工程技术应用与安全性问题,产品名称 治疗功能与医药范围 1.人胰岛素

49、 治疗糖尿病 2.人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3.干扰素 治疗癌症、病毒感染 4.干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5.干扰素 治疗癌症、病毒感染 6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8.超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9.凝血因子 治疗A型血友病 10.乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11.神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12.脑啡肤 镇痛 13.降钙素 治疗骨质疏松症,生产蛋白质和多肽类活性物质,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,制备基因工程疫苗 基因工

50、程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。,改良物种特性,动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的蛋白产品把YFG放在乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内YFG在乳腺中表达乳汁中提纯YFG蛋白。,2.7.2 基因工程的安全性问题,对转基因生物安全性的争论应正确认识转基因生物的利与弊转基因生物的安全管理,基因工程2.7 基因工程技术应用与安全性问