动物细胞工程-单克隆抗体制备.ppt

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1、1.为什么要培养动物细胞？2.要培养动物细胞，对取材有何要求？,实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等,选择胚胎细胞或幼年动物组织，因为其分裂增殖能力强。,3.培养基是用液体的还是固体的？培养基中的成分有何特点？,培养基是液体的，成份与动物内环境相似。动物血清,4.动物细胞培养条件有何特点？,体温和PH都应与动物体内环境相似。,动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,5.培养动物细胞需要哪些条件？,液体、营养物质（血清）、PH、温度、气体、无菌等,动物组织块,细胞悬液,原代培养,传代培养,胰蛋白酶处理分散成单个细胞,幼

2、龄动物的器官组织；动物胚胎,细胞贴壁接触抑制,原代培养传代培养,加入培养液,用胰蛋白酶等处理贴壁细胞,适宜条件,不死性细胞,胚胎移植,体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）,体细胞核移植技术存在的问题,（1）成功率非常低（2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题,1970年，有两位科学家做了一个著名的实验：人鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。,人鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？,三、动物细胞融合与单克隆抗体1.细胞融合：是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。自然发生：受精卵人工诱导：利用诱导剂诱导动物细胞融合 诱导因素：聚乙二醇、灭活的病毒或电激

3、等。,什么是病毒的灭活？,灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。,灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合,正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞,正在融合的鸡血细胞,动物细胞融合的原理：,细胞膜的流动性,把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交细胞。融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交

4、细胞,2.动物细胞融合技术的应用：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；为制造单克隆抗体开辟了新途径,使用相应的抗体检测乙肝病毒抗原,3.单克隆抗体的制备 医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？,乙肝病毒模式图,凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原。,什么是抗原？,例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。,抗原决定簇：抗原表面具有的某些特定的化学基团，能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗原的重要依据。各种抗原的决定簇数目不同，同一抗原的决定簇可能有多种。,什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？,当机体受到抗原刺激剂后由效应B细胞（浆细

5、胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白抗体。抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。,抗体与相应抗原特异性结合,抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里?,血清抗体（也称多克隆抗体）由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体。特点：产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。,抗原不纯,抗体不纯,每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体单克隆抗体。,问题：怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？,在体外培

6、养的条件下，一个B淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？,肿瘤细胞！,科勒,米尔斯坦,荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖,如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。,如何诱导融合？,加入聚乙二醇（PEG）,如何得到B淋巴细胞？,3.制备单克隆抗体的过程,细胞两两融合后，有哪些类型？,B-B B-瘤(杂交瘤细胞)瘤-瘤,如何筛选出杂交瘤细胞？,单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。首先用选择培养基

7、筛选出杂交瘤细胞,细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？,小资料：,在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。,通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检

8、测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。,再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞,阳性孔,方法抗原-抗体杂交法,在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。,如何得到大量的单克隆抗体？,体内培养体外培养,单克隆抗体 化学性质单一、特异性强,抗体 抗原 应答 抗体的不纯性,动物细胞受到抗原刺激,引起免疫反应产生的球蛋白.,不是自己的而又能引起免疫应答反应的物质就是抗原.,一种抗原有多种不同的决定簇,刺激的是多种B细胞,作用于不同的B细胞后,会产生多种抗体,这是多克隆的,故不纯!,1.制备单克隆抗体的思路,

9、怎么才能得到纯的抗体?光纯还不行,还要大量.怎么办?但，有问题:找，什么细胞能无限繁殖呢?思路就出来了:,要想获单一的纯抗体,就必须从一个B细胞出发.,让B细胞大量繁殖(克隆)就可以产生大量抗体了.,B细胞是不能无限繁殖的.怎么办?,癌!只有癌细胞.但它不能产生抗体.,癌细胞能无限繁殖,但不能产生抗体.B细胞能产生抗体,但不能大量繁殖.融合呀!只要将两个细胞融合即可互补.,2.技术思路的重点,问题:在培养体系中,有4种细胞.B细胞、瘤细胞,和杂交细胞。我们还是拿不到McAb,怎么办?筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛?又是一个思路问题。,单克隆抗体,杂交细胞,杂交瘤细胞,骨髓瘤细胞,特异性杂交瘤细胞

10、,杂交瘤细胞系,提取,经过免疫的B淋巴细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,单克隆抗体的制备过程：,特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖,特点：特异性强灵敏度高可大量制备,4、单抗隆抗体的应用,作为诊断试剂,定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病,用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。,用于治疗疾病和运载药物,利用同位素标记单抗，在特定组织成像,制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。,单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。,用于治疗疾病和运载药物 特异性强、灵敏度高 生物导弹单克隆抗体抗

11、癌药物 疗效高、毒副作用小,结合同位素的单抗,-生物导弹,单抗,放射性同位素,动物细胞工程小结,动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用 动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术,图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_。,1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案,该实验方案的目是；,A是从小鼠的脾

12、脏中取得_,该细胞能够产生；,制备单克隆抗体,B细胞,专一抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌专一抗体,无限增殖,单克隆抗体的制备,1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？2、从何处获得较多的B淋巴细胞？3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4、怎样筛选出杂交瘤细胞？5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？7、怎样获得大量的单一抗体？,反复注射特定的抗原，免疫小鼠。,小鼠的脾脏,PEG、灭活的病毒等,利用HAT选择培养基培养，筛选,否,用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测呈阳性反应,体内或体外大量

13、培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。,单克隆抗体,杂交细胞,杂交瘤细胞,骨髓瘤细胞,特异性杂交瘤细胞,杂交瘤细胞系,提取,经过免疫的B淋巴细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,单克隆抗体的制备过程：,特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖,特点：特异性强灵敏度高可大量制备,1975年Kohler和Milstein的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图10示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：图10（1）该技术是在动物细胞培养技术和 技术的基础上发展起来的。（2）图10中细胞A体外培养不具有分裂能力，但能分泌，细胞B体外培养能够。（3）动物细胞融合常用的方法是。,

14、图10,（1）动物细胞融合（2）分泌特异性抗体、无限增殖（3）PEG（灭活的病毒、电刺激）,（4）细胞融合是随机的过程，在HAT培养基中培养，要筛选出 细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入（激素）。（5）培养2周后，即测定培养细胞的特征，筛选出 细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到710个细胞/ml，每孔滴入0.1ml细胞稀释液，其目的是。（6）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行 培养。,（4）杂交瘤、胰岛素（5）特异性分泌抗X蛋白抗体的、保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）、（6）体

15、外或体内,写出、所指的细胞工程各称：。实施细胞工程时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。多莉面部的毛色是，判断依据是：。继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有。请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义：。,2.世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：,核移植,胚胎移植,卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有启动核基因表达的物质,白色,多利的核基因全部来自白面绵阳,全能性,保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官,3.科学家用小鼠骨髓癌细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓癌细胞融合的是 A.经过免疫的B淋巴细

16、胞B.不经过免疫的T淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞 D.不经过免疫的B淋巴细胞,A,4.科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐鼠的子宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是 A.黑、雌 B.褐、雌 C.白、雄 D.黑、雄,A,5.将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是 A.B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖 B.B淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体 C.骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体 D.骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能增殖（多选）,AC,C,4单克隆抗体是指 A、单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体

17、 B、单个B淋巴细胞增殖产生的抗体C、单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体 D、单个抗体通过克隆化，产生大量抗体,5.下列哪一项属于克隆？A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B.将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内 C.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞 D.将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系,D,6.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能 A有选择地繁殖某一性别的家畜 B.繁殖家畜中的优秀个体C用于保存物种 D.改变动物的基因型,D,7.在动物细胞融合和植物体细

18、胞杂交的比较中，正确的是（）A.结果是相同的 B.杂种细胞的形成过程基本相同 C.操作过程中酶的作用相同 D.诱导融合手段的手段相同,B,8.已知细胞合成DNA有 D 和 S 两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般DNA不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：,试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞,2,设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的

19、骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。,制备单克隆抗体,1、常规抗体获得的方法及其特点2、单克隆抗体制备的原理,利用 产生特异性抗体的功能。利用 无限增殖的特性。利用 技术将两种细胞融合获得 杂交瘤细胞。利用 技术大量培养杂交瘤细胞。,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,动物细胞融合,动物细胞培养,3、单克隆抗体的制备4、单克隆抗体的应用,（1）融合后的杂种细胞容易成活吗？（2）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程技术手段？（3）在整个制备的过程中要经过几次筛选？,思考：,细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越

20、易成活,细胞融合技术、细胞培养技术,.筛选得到杂交瘤细胞，.筛选先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交 瘤细胞下培养筛选出特异抗体的细胞群,怎样筛选出B淋巴细胞和骨髓瘤细胞间融合所形成的能产生特定抗体的杂交瘤细胞？,用抗体检测和克隆化培养得到能分泌所需抗体的杂种细胞专一抗体检测。,18.如何利用杂交瘤细胞来大量生产单克隆抗体？,将杂交瘤细胞在体外大规模培养，从细胞培养液中就能提取大量的单克隆抗体；把杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖，再从小鼠腹腔中提取单克隆抗体。,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所

21、需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂

22、交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。,实验过程要解决的问题：1、如何使机体产生能分泌抗体的B淋巴细胞？2、从实验动物的什么部位提取B淋巴细胞？3、机体内什么细胞能无限增殖？3、用什么方法诱导细胞融合？4、杂交瘤细胞有几种类型？制备单克隆抗体需要哪种类型？5、如何筛选杂交瘤细胞？,根据

23、下面植物体细胞杂交技术流程图回答相关问题：（1）若运用传统有性杂交（即用番茄、马铃薯杂交）能否得到杂种植株？为什么？_.,不能，不同种的植物存在生殖隔离,（2）在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中，运用的技术手段是_，依据的原理是_,其中过程称为_，与过程密切相关的具有单层膜结构的细胞器为_，过程相当于_，过程 涉及到的分裂方式为_。,脱分化,细胞的全能性,原生质体融合,高尔基体,植物组织培养,有丝分裂,（3）已知番茄、马铃薯分别是二倍体和四倍体，则“番茄-马铃薯”属于_倍体。（4）随“神六”太空旅行的种苗中，最受关注的是采油树的试管苗。柴油树种子中含有的柴油是植物细胞的代谢产物，可用植物组织培养来实现柴油的工业化生产。若利用此技术，将采油树细胞培养到_过程即可（填字母编号）,6,e,（5）若培育抗虫棉，将抗虫基因通过适当的途径导入棉花受精卵，然后进行组织培养，该过程相当于_（填字母编号）（6）人工种子又称合成种子或种子类似物，他是20世纪生物技术在农业上的应用之一。由发育到_过程（填字母序号）的结构包裹上_可制备人工种子。,f,人工种皮,