动物实验设计与实施.ppt

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1、动物实验设计与实施,南方医科大学实验动物中心,第一部分：动物实验设计和实施的基本过程,一、选择研究题目1、广义的选择2、狭义的选择3、政府法规需要,正确选题应遵守的几个基本原则；1、科学性：是指选题应建立在前人的科学理论和实验基础上，而不是毫无根据的胡思乱想。2、目的性：指选题应具有明确的理论意义和实践意义，要能解决具体问题。3、创造性：指选题应具有自己独到之处，或提出新规律、新见解、新技术、新方法，或是对旧有的规律、技术、方法有所修改、补充。4、可行性：是指选题应切合研究者的学术水平、技术水平和实验条件，还要结合研究者的工作基础，使实验能够顺利实施。,二、提出假说,假说提出的一般过程：1、观

2、察和记录所有相关的信息（包括研究者已开展的初步实验结果）2、分析和归类这些信息3、在这些信息的基础上提出假说,假说是预先假定的答案或解释，亦既是实验的预期结果。对于动物实验研究来说，假说是十分必要的。假说是实验研究设计的前提，如果没有假说，实验和观察就失去目标。假说关系着实验研究的目的性、计划性和预见性。对假说既应努力加以验证，又应适时加以抛弃，重新建立新的假说，再加以验证。这样才有可能使正确的假说上升为结论、原理和学说。研究者开展动物实验前，应在熟悉有关实验动物理论知识和动物实验技能的基础上，积极进行逻辑思维，结合实际条件，提出创新性课题和大胆的假说。,三、选择研究材料,主要是用于制作实验需

3、要的动物模型,常规品种（系）特殊品种（系）：疾病模型动物、转基因品系等高峰期特殊规格：F1、乳鼠等外购：外地、外国、非商业性单位等,四、准备研究方案,1、示意性的实验设计，包含了实验过程中的各种处理2、对实验操作过程的解说和测量方法的描述3、简述可能对动物造成的不适4、应用动物的例数和所用的统计学方法都应当加以说明5、简述实验准备情况，包括准备的方法、过程和分析的资料6、实验中的一些实际情况：人员需求、实验负责人姓名、所需经费,实验方法的选定,实验方法按学科可分为生理学方法、生物化学方法、生物物理方法、免疫学方法等；按性质可分为形态学方法、机能学方法按范围可分为整体综合方法和局部分析方法按水平

4、分：整体水平、器官水平、细胞水平、亚细胞水平、分子水平和量子水平等。,无论选用何种实验方法，均应保证以下几点:可靠性：即切实可行，稳定可靠，是大家公认的方法，也即是经典方法。优越性：指实验方法既具先进的一面，又便于与其它实验方法相互配合，故也称先进性和协同性。创造性：即实验方法的创新和改良。,例：外源基因转染的细胞体内移植研究测定方法：整体水平：测定体液的生理生化指标细胞和亚细胞水平：光镜和电镜观察RNA水平：原位杂交法测定mRNART-PCR法半定量测定RNA表达量Northern法定量测定。蛋白水平：免疫组化与生物体视学结合Western blotting定量测定Elisa法测蛋白活性,五

5、、动物实验前的条件准备,主要内容：准备好实验仪器、药品、试剂和实验动物。实验条件的准备要求是尽可能使实验手段和实验方法标准化。实验仪器必须校准，必须事先熟悉仪器使用方法。a、还要和相关科室联系，达到部分仪器共享使用的目的。同时注意某些学科不太常用的仪器设备是否存在，是否会影响实验指标的检测；b、测定动物生理、生化、生物电和器官功能指标的各种分析仪器和描记仪，如半导体测温计、动物血压表、多导生理记录仪等设备。药品的纯度应有明确要求，试剂的配制必须严格遵守操作规程，尤其是麻醉剂的使用。器械准备、实验场所消毒与器具配套等也要落实，特殊器械是否准备：如显微外科或眼科手术器械。,实验动物的准备,购入或领

6、取实验动物前，应进行各项计划的核实，检查各项实验前的准备工作，如动物笼盒数量、饲养室卫生及消毒情况。购入或领取实验动物时，应向供应部门索取所用动物的遗传背景和微生物控制质量资料、以及动物品系、年龄、体重、胎次等资料。根据实验观察时间长短的需要，同时购入或领取相应数量的饲料和垫料。若是从外地购入动物需长途运输时，还应考虑到途中各种因素对动物的影响，如运输环境的温度，湿度、饮食。尤其注意途中污染和窒息死亡以及应激反应等问题。应隔离检疫并提供3周左右的动物适应期。若是购入或领取清洁级以上实验动物，应采用带有空气过滤膜的无菌运输罐或带有滤帽的笼盒运输，严格检查其密封状况。术前准备：术前3天单笼饲养，术

7、前824小时禁食、禁水。,六、预 实 验,是在动物实验前对正式实验进行初步实验。目的在于检查各项准备工作是否完善，实验方法和步骤是否切实可行，测试指标是否稳定可靠，初步了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实验提供补充、修正的意见和经验，是动物实验必不可少的重要环节。预实验可用少量动物进行，实验方法和观测指标应该和正式实验一样，但预实验的结果不能归入正式实验的最后结果中一同分析。预实验一样要得到伦理委员会的审批才可实施。,七、实验的详尽方案和实施,1、需要准备一个动物实验的日程表，写上简单明了的实验方案，实验过程应该描述清楚，注明对实验动物品种、品系的选择，动物的营养、饲喂方式和时间的选择，

8、样本的采集和安乐死的方式。2、详细的草案还应该包括实验者、实验动物和实验技术等几个方面的问题。实验技术如给药途径和方法、术式、麻醉方法和深度、复苏和抢救措施等。3、实验结束时收集所有的实验资料，进行各种后续指标的检测，包括运用数学统计的方法分析处理实验数据。4、分析结果是否证明了原来的假设。,实验动物常用的采血方法尾尖采血：常用于大小鼠，小量采血。可以多次采血。眼眶静脉丛采血：常用于大小鼠、沙鼠的采血。摘眼球采血:血量较多，常用于大小鼠、沙鼠腹主动脉采血：常用于大小鼠、沙鼠，心脏采血：兔耳缘静脉或耳中动脉、颈动脉采血犬：在前肢静脉、后肢小隐静脉采血猴：可在指尖、足跟、后肢皮下静脉、颈静脉采血猪

9、：小型猪为耳大静脉、后肢静脉,实验动物各种采血方法的采血量,一、小、大鼠1、剪尾采血此法每鼠可采10次以上。小鼠每次0.1ml。大鼠每次0.4ml。2、眼眶后静脉丛采血小鼠每次大鼠每次0.5ml 2、股动脉采血小鼠每次0.5ml小鼠每次0.5ml,二、豚鼠耳缘切口采血：0.5ml。心脏采血：足背正中静脉采血：三、家兔耳缘静脉采血：5-10ml。耳中动脉采血：15ml。心脏采血：20-25ml。四、犬前肢皮下头静脉和后肢外侧小隐静脉采血：10-20ml。颈静脉采血：心脏采血：,常用实验动物的最大安全采血量与最小致死采血量,采集体液,胸水的采集腹水的采集消化液的采集尿液的采集骨髓液的采集动物精液的

10、采集乳汁的采集,尿液的采集,代谢笼法：此法较常用于大、小鼠：成熟小鼠尿量1-3ml/24h，大鼠为55-75ml/24h导尿法：常用于雄兔、犬等动物，要轻度麻醉，可以采到无污染的尿液。压迫膀胱法：此法适用于兔、猫、犬等大动物。输尿管插管法膀胱插管法膀胱穿刺法剖腹采尿法反射排尿法：适用于小鼠,病理取材基本要求病理检查应分层次进行，先进行一般外观观察，然后剖检观察，再进行光镜详细检查。通常选择正常与病变交界处组织，即包括病变本身及病变周围组织。对照组动物相同器官取材时，选材部位应尽量一致。肉眼看不到明显病变时，各试验组选取标本位置应一致。所选组织应包括脏器全部层次结构或重要结构，如肾应包括皮质、髓

11、质和肾盂。体积大和分叶的器官，应视不同组织选取多个部位，小器官可整体取材并固定，如淋巴结、扁桃体、甲状腺等。胃肠标本应将内容物冲洗掉，以免内容物影响组织的固定，产生自溶。所取材料应尽量保持肉眼标本的完整性，不宜过厚或过薄，一般厚约3-5mm，大小为1.5-2cm。切取组织时不要挤压，使用锋利刀具，少用剪刀，勿选用被器械钳压过的部位。标本取材要熟练，尽可能快的完成整个过程，特别是易自溶的组织，如肠道、脑、腺体等。剖检记录应客观、详细，用形象描述而不能用诊断的病名来代替。同一实验中的对照组和实验组动物应交叉剖检，严格统一各种条件和操作，尽量避免各种可能的干扰因素。,“安死术”的概念：即安乐死术，是

12、指以人道的方法处死动物过程。在处死动物的过程中尽量减少动物的惊慌、焦虑，使其安静地、无痛苦地死亡。安死术的常用方法颈椎脱位法：是将实验动物的颈椎脱臼，脊髓与脑髓断开，动物无痛苦死亡，大、小鼠最常用。空气栓塞法：处死兔、猫、犬等较大动物常用此法，兔、猫为20-40ml，犬为80-150ml.放血法：一次性放出动物大量血液致使死亡，动物安静，痛苦少，脏器无损伤，采集病理切片很有利。可用于小鼠、大鼠、兔、犬等。断头法：剪刀剪头，大量失血死亡。脏器含血量少，适于采样。药物法：药物吸入：吸入有毒气体或挥发性麻醉剂。适用于小鼠、豚鼠等小动物。药物有CO2、CO、乙醚、氯仿等。药物注射：药物注射致死，适用于

13、豚鼠、兔、犬等较大动物。药物有氯化钾、巴比妥类麻醉剂等。,采用安死术必须符合的标准死时无惊恐、疼痛表现。使其在最短时间内失去意识迅速死亡。方法可靠且可重复。对操作人员安全。采用的方法要与研究要求和目的一致。对观察者和操作者的情绪影响最小。对环境的影响最小。需要的机械设备简单、价廉、易操作。处死动物地点应远离并与动物房隔开。,实验动物常用的给药方法和途径一、经口给药自动口服给药：灌胃给药:二、注射给药：皮下注射给药皮内注射肌肉注射给药静脉注射给药腹腔注射给药脑内注射：椎管内注射：关节内注射：淋巴囊注射：蛙类常采用此法三、其他途径给药（吸入给药等）,人与实验动物之间药物剂量的换算,人与实验动物对同

14、一药物的耐受性，动物比人大，即单位体重的用药量比人要大。一般可按下列比例换算，每单位体重人的药量为1，则小鼠、大鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。,常用药物的最大给药量,麻醉方法：全身麻醉和局部麻醉，通常通过吸入和注射（静脉、皮下、肌肉、腹腔）途径。常用麻醉药物：乙醚（吸入），戊巴比妥钠、硫贲妥钠、氯胺酮（静脉），普鲁卡因、利多卡因（局麻）,常用麻醉药的剂量及注射途径,麻醉注意事项,麻醉前应禁食8h以上麻醉前应准确称体重注意麻醉剂量麻醉过程中注意观察动物的反应情况注意保温静脉注射时必须缓慢，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平,八、评估和报告,1、标题和实验者：

15、包括所有参与实验研究的人员。2、摘要：简要介绍实验研究的目的、实验设计、实验方法和结论。3、导论：简单地介绍相关的背景知识、国内外类似研究现状，提出可能的假设。如果假设不成立的话陈述一下预期的结果。4、材料和方法：5、实验结果：通过图形、表格和文字等将实验结果展示出来，文字要简介扼要。6、实验结论：简单扼要的得出实验结论，说明假设被证明的情况和取得的科研成果，为将来的研究提出好的建议。7、致谢8、参考文献,实验动物：遗传背景、品种品系（近交系、封闭群或是其它特殊遗传质量控制）和正确的命名、模型的制作、动物的年龄、性别、体重、微生物控制等级等。动物实验条件：实验设施的类型、温度、湿度、气流、光照

16、、笼具类型、饲养密度、垫料、运输和喂养的时间等。营养：饲料（包括厂商、成分、配方、灭菌、质量控制方案等）、采食情况（自由采食、限制饮食还是二者兼有）、饮水情况（自由饮水、自动化供应、瓶装、消毒、水质）。实验程序：化学物质、药品（剂量、厂商、纯度、添加剂）、实验持续时间、生理状况、给药途径、样本的采集、麻醉方法、安乐死方法、标本的采集处理和组织器官的保存等。实验设计：设计方法、评估方法和统计方法等。如果是在国外还应该注明实验动物管理委员会对实验方案的审批情况。,BALB/c（nu-nu）裸鼠20只，18-22g雌雄各半由南方医科大学大学实验动物中心提供动物质量许可证：广实动管第01号实验鼠在SP

17、F条件下饲养，饲喂全价小鼠颗粒饲料，自由采食和饮水实验方法：*。实验第7天，颈椎脱臼处死动物，*。,动物名称和遗传背景动物数量和体重性别动物来源动物质量资料实验饲养条件安死术,第二部分：动物实验组织和管理,概 论 使用实验动物进行生物医学研究计划不是一个人能够实施的，是一个涉及很多人、复杂的研究过程。动物实验研究需要各种人员进行适当的分工、配合。研究人员设计、组织和实施动物实验和经费管理，撰写研究报告；有动物实验资格的技术员按照实验设计进行具体的实验操作；动物饲养员日常饲喂、管理；实验动物管理委员会检查实验中动物的福利是否得到保障、实验方法是否人道等。,一、关于动物实验的法律、法规和相关要求,

18、1、动物实验方案是否符合国家法律？在很多国家，不是所有关于动物实验的方案都可以实施。2、所利用的动物实验研究机构是否是政府部门认可的有权进行动物实验的机构。3、研究人员进行动物实验设计和实施的资格。4、是否有充分的理由解释使用动物进行研究的必要性。5、是否有足够的专业人员（饲养员、技术员等）来保证实验顺利进行。6、实验动物的来源是否合法，是否符合实验动物的各种标准化控制条件。7、是否与当地的动物福利机构有了沟通。8、研究计划的进行是否得到实验管理委员会的批准。9、是否有完整的实验记录。,实验动物管理委员会（IACUC）实验动物福利和伦理管理委员会,二、动物实验的影响因素的控制,要尽可能满足下列

19、条件，使实验和动物的变异降到最小。,一、动物因素 种属、品种、品系、年龄、体重及性别、生理状态、健康状况二、环境因素 温、湿度、气流、洁净度、光照、噪声、营养、饲喂、环境微生物 三、技术因素 实验季节、昼夜过程、麻醉深度、手术技巧、用药途径和方法等,三、相关规范、规程和认证,优良实验室操作规范GLP（Good Laboratory Practice,GLP)是国际上通用的具有良好的质量管理规范的简称，是药品安全性评价过程中就组织管理、项目实施、记录报告、资料保存等方面所制定的法规，其目的在于保证药品安全性评价的完整性、可靠性和重复性。尽管GLP最初目标是为了保证动物实验在药物毒性研究中的准确性

20、，将GLP规则推广到其它涉及动物实验的研究领域中，有利于这些研究项目的标准化，增加实验结果的重复性。当然，GLP规则并不能适合所有的动物实验研究，因为每一类型的动物实验对于标准化都有其自身特殊的意义。药物安全性评价实验包括：单次给药毒性试验、反复给药毒性试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、局部毒性试验、免疫原性试验、安全性药理试验、依赖性试验、毒代动学试验等。,标准操作规程SOP（Standard Operating Procedure,SOP）:为有效地实施和完成某一试验研究中每项工作所拟定的标准和详细的书面规程。针对动物实验研究主要的SOP规范有：对动物饲养、卫生、实验技术、观测方

21、法、动物检查、数据收集和处理等都要有标准的SOP操作规程。动物分组与识别的SOP、饲养管理SOP、观察记录及实验操作的SOP、动物尸检以及组织病理学检查处理的SOP、动物尸体及其他废弃物处理的SOP、实验标本的采集、编号和检验的SOP、数据统计处理的SOP、资料档案管理SOP等,AAALAC认证 实验动物管理评估和认证协会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care,AAALAC）:非赢利的私人组织，权威的评估和认证动物饲养和使用标准的国际机构，它要求人道、科学地对待动物。FDA和欧盟强力推荐在有

22、AAALAC认证的实验室开展的动物实验。世界500强医药巨头联合申明，他们医药产品的动物实验都将在AAALAC认证单位完成。AAALAC认证在世界范围内享有很高的声誉，为实验动物领域树立了高标准的楷模。（目前世界上已有29个国家的770多个机构通过了AAALAC认证。中国有12个机构通过了AAALAC认证，广东地区广州医工院通过Beagle犬认证）,广西食蟹猴实验动物研发基地,广西：南宁国家高新区投资建成了“广西南宁国际灵长类动物模型与医药产业化示范基地”，是国内第一家通过国际资质认证的灵长类实验动物室,四、动物实验集中化,实验动物供应室：进行实验动物生产、采购、饲养、检疫。实验动物旅馆：除了

23、第一类服务范围外，还可以安置、喂养不常用动物或需要特殊安置的动物。如羊、犬、灵长类等。但是如果进行外科手术、X射线、胃镜等检测时还需要更换地方进行相关项目检查。动物实验中心；是动物实验集中化的最高形式，基本可以满足一站式服务。,我校的动物实验设施,南方医科大学东莞松山湖实验动物科技园,东莞松山湖科技产业园区Dongguan Songshan Lake Sci.Lake,五、实验的时间安排,1、必须留出足够的时间购买动物。2、必须留出必要的检疫期。3、充分估计到动物不可预料的死亡或是自然死亡可能给实验带来的影响。4、必须留出足够的时间来学习和掌握新的技术。5、必须留出足够的时间来准备特殊的动物饲

24、料。6、进行必要的预实验。7、得到管理部门的许可。8、落实动物实验所需的后勤资源保障：如动物房、饲养人员、实验操作技术人员、试剂购买、所需配备的特殊设备（层流架、隔离器等）,六、与他人协作,研究组人员要保持沟通，及时总结经验，对下一步工作进行预计。出现问题后商量如何调整实验进程等等。要保证有一个和谐的研究团体，强调各个环节的协作性。,西藏小型猪器官移植和转基因克隆研究,七、动物实验的安全性,1、正视实验动物饲养和实验环境对动物的影响，严格控制各种影响实验结果的动物疾病，尤其是动物传染病，如小鼠仙台病毒、兔脑炎病毒等。2、严格控制各类人兽共患病的发生，尤其是使用野生动物（如灵长类动物）时，由于高

25、等级动物和人类的亲缘性更近，其疾病的易感性更强，要特别注意安全保护。如出血热、狂犬病、传染性肝炎、猴疱疹病毒、布鲁氏菌病等。3、感染动物实验：专门的感染动物实验设施，如P3实验室（生物安全防护3级实验室）。,实验动物病原分类,A:人畜共患病B:实验动物致死病原C:非致死但可引起实验动物发生疾病或生理功能改变D:条件致病菌E:非病原但可为反映实验动物微生物控制的指标,第三部分：动物实验设计,一、动物实验设计的概念二、动物实验设计“三要素”1、实验对象(subject)2、实验因素(treatment factor)3、实验效应(experimental effect),降压药,高血压大鼠,血压值

26、,其他因素,其他效应,1）实验对象。实验所用的材料即为实验对象,或称为受试对象。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。2）实验因素。所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。处理因素或受试因素：根据研究目确定的欲施加或欲观察的、并能引起受试对象直接或间接效应的因素，简称处理或因素(factor)。是根据研究目的确定的主要因素，处理因素在整个实验中应始终要保持不变 非处理因素：对评价处理因素作用有一定干扰，但研究者并不想通

27、过实验考察其作用大小的因素，常常又称混杂因素(confounder)。,确定处理因素时要注意的几个问题：要抓住实验中的主要因素。要在众多的因素与水平中抓住主要的、带关键性的某几个因素。例：病毒培养方法改进实验要根据实验目的确定处理因素和非处理因素，一旦确定就不能随意改动。例：冷水浸泡实验处理因素必须标准化：保证处理因素在整个实验的过程中始终如一，保持不变。,3）实验效应。实验因素取不同水平时在实验单位上所产生的反应称为实验效应。实验效应是反映实验因素作用强弱的标志，它必须通过具体的指标来体现。,所选定的指标，应符合下列基本条件：特异性：指标应特地反映所观察事物的本质，即能特异地反映某一特定现象

28、，不致与其它现象相混淆。客观性：最好选用可用具体数值或图形表达的指标（如心电图、化验检查等），客观指标是测量和检验的结果，是借助仪器来回答的；而主观指标（如一些定性指标）是实验者自己判断的，易受主观因素的影响而造成较大误差。重复性：重复性高的指标一般表示无偏性或偏性小、误差小，能较真实的反映实际情况。不选用重现性小的指标。,灵敏性；指标测量的技术方法或仪器灵敏度十分重要。该测出的变化测不出，就会得出“假阴性结果”，仪器不精密，所得阳性数值则不真实。技术和设备的可能性：尽量选用既灵敏客观，又切合本单位和研究技术和设备实际的指标。指标选定必须有根据；现成（定型）指标必须有文献依据，自己创立的指标必

29、须经过专门鉴定。对一些半客观（比如读pH试纸上的数值）或主观指标的判断上，一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析自己的实验结果，从而也大大提高了自己实验结果的可信度。,例：慢性酒精性肝损伤动物实验研究：过氧化脂质反应的相关检测：超氧化物歧化酶SOD丙二醛MDA还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH)脂质过氧化物LPO甘油三酯TG肝功能指标：谷丙转氨酶谷草转氨酶其它可选指标：琥珀酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等酶系活性；总蛋白、总胆固醇等血清生化指标；IL-8、TNF等炎性因子。,三、动物实验设计的基本原则 实验研究主要是通过对样本的研究而得出结论。要将样本的结论外推到总体，必须尽量

30、使样本能够真实地代表总体。但是，实验动物的种系和个体差异、实验环境差异、仪器的稳定性、药品的纯度、样本的大小等因素都可能产生实验误差，影响样本结果的代表性。为避免或缩小误差，实验设计时必须注意误差控制。为此，动物实验设计应遵循如下原则：对照的原则随机化原则重复的原则一致性原则弹性原则 最经济原则,1、对照(control)：对照的意义在于它可以使处理因素和非处理因素的差异有一个科学的对比。对照组与实验组的非处理因素相同，非处理因素的影响得到抵消，使处理因素的效应得以显露。,处理组 处理因素+非处理因素 处理效应+非处理效应对照组(无)非处理因素(无)非处理效应比较结果 处理因素 处理效应排除“

31、非处理因素”的影响，从而衬托出“处理因素”的作用。,对照组设置的要求：(1)对等：除处理因素外，对照组具备与实验组对等的一切非处理因素，具有高度的可比性。(2)同步：对照组与实验组设立之后，在整个研究进程中始终处于同一空间和同一时间。(3)专设：任何一个对照组都是为相应的实验组专门设立的。不得借用文献上的记载或以往的结果或其它研究的资料作为本研究之对照。,对照的种类：1、组间对照空白对照安慰剂对照实验条件对照标准对照2、自身对照,空白对照,对照组不施加任何处理因素。特点：简单易行，但容易引起心理差异，从而影响实验效应的测定。只有在处理因素很强，非处理因素很弱的情况下使用。,安慰剂对照,安慰剂：

32、无药理作用，其外观如剂型、大小、颜色、重量、气味及口味等与试验药物一致,不为受试动物所识别。例如：以安慰剂为对照，研究使用艾拉莫德片对类风湿性关节炎的治疗效果。目的：克服研究者、受试对象、评价者等由于心理因素所形成的偏倚；还可消除疾病自然进程的影响。,实验条件对照,对照组不施加处理因素，但施加某种与处理因素相同的实验条件。包括操作技术、被试因素溶媒或其他载体等。凡对实验效应产生影响的实验条件宜采用此法。例如：观察赖氨酸对幼年动物发育的影响，实验组动物饲喂含赖氨酸的颗粒饲料，对照组动物饲喂不含赖氨酸的颗粒饲料。,含赖氨酸颗粒饲料+非处理因素赖氨酸效应+颗粒饲料效应+非处理因素效应,颗粒饲料+非处

33、理因素 颗粒饲料效应+非处理因素效应,标准对照,对照：用现有标准方法或常规方法作对照，如药理学研究中，用已知的有效药物、有效疗法或公认的标准疗法作对照。在实验室研究中常用于某种新检验方法是否能代替传统方法的研究。,自身对照,在同一个体身上观察实验处理前后某种指标的变化，即把实验处理前的观察指标作为实验处理后同一指标变化的对照，可有效减少个体差异对实验处理反应的影响。例如：机体对称部位自身对照：研究某治疗烧伤新药的疗效，就可选用有对称部位被烧伤(如双前肢或双后肢等)的受试对象，一部位用烧伤新药，另一部位用其它公认有效药物,2、随机化(randomization)：除了处理因素外，其它所有可能产生

34、混杂效应的非处理因素在各组中（对照和实验组）尽可能保持一致，保证和提高各组的均衡性，也是资料统计分析时进行统计推断的前提。,抽样随机 每一个符合条件的实验对象参加实验的机会相同，即总体中每个个体有相同的机会被抽到样本中来；保证样本的代表性。分组随机 每个实验对象分配到不同处理组的机会相同，保证其他因素在对比组间的均衡性。实验顺序随机 每个实验对象接受处理先后的机会相同；使实验顺序的影响也达到均衡。,机会均等,随机化的方法,抽签或掷硬币 随机数(random number)：随机数字表和计算机(或计算器)的伪随机数发生器。实验设计中常用的两种随机化方法：完全随机化和分层随机化,完全随机化(com

35、plete randomization),直接对受试对象进行随机化分组(1)编号：将n个受试对象编号，动物可按体重大小。(2)取随机数：可从随机数字表或计算器或计算机获得。每个受试对象获得的随机数可是一位数，也可是两位数或三位数，一般要求与n的位数相同。(3)确定组别：根据受试对象获得的随机数决定受试对象在哪一组。分两组可按随机数的奇偶；分k组可按随机数除以k后的余数进行分组。,完全随机-例：试将同性别、体重相近的15只动物分到A、B、C三组,(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15),8856532759,3335726747,77

36、34554570,BCCAC,CBBAB,ACABC,12202,02012,21101,先对可能影响实验过程和结果的混杂因素进行分层，然后在每一层内进行完全随机化。配对随机化(paired randomization)和区组随机化(block randomization)可看成是分层随机化的实际应用。基本步骤：分层编号排序：将每层的受试对象编号排序，如体重从轻到重，时间由前至后等。取随机数：同样可从随机数字表或计算器或计算机获得。确定组别：根据每层受试对象获得的随机数的大小顺序决定受试对象在哪一组。,分层随机化(stratified randomization),例:为比较四种抗癌药物(A,

37、B,C,D)的疗效，将小鼠体重作为分层或区组因素，试分配处理。,3、重复(repetition)：是消除非处理因素影响的又一重要手段，重复的目的是使均数逼真，并稳定标准差，这样才使统计量（样本指标）代表参数（总体指标），统计推断才具有可靠的前提。重复程度表现为样本含量的大小和重复次数的多少。可靠性整个实验的重复:确保实验的重现性，以提高实验的可靠性；用多个受试对象进行重复：避免把个别情况误认为普遍情况，把偶然性或巧合的现象当作必然的规律，通过一定数量的重复，使结论可信；同一受试对象的重复观察:保证观察结果的精度。例如，血压一般都测3次，以3次的均数作为最终结果。,重复例数的决定因素：实验处理效

38、果的明显性实验误差的大小动物个体变异的大小资料性质第一类误差第二类误差实验设计的类型,样本含量估计的意义,过小，所得指标不稳定，用以推断总体的精密度和准确度差；检验的功效低，应有的差别不能显示出来，难以获得正确的研究结果，结论也缺乏充分的依据。过大，会增加实际工作的困难，浪费人力、物力和时间。,重复例数的计算方法：1、一般估测法小动物(大鼠、小鼠、蛙、鱼)：每组10-30例,计量资料每组不少于10例,计数资料每组不少于30例；中等动物(豚鼠、家兔)每组8-20例,计量资料每组不少于8例,计数资料每组不少于20例；大动物(犬、猫、猪、羊等)每组6-20例,计量资料每组不少于6例,计数资料每组不少

39、于20例.,2、假设检验时通过公式计算或查表：需明确如下指标：所比较的两个总体参数间的差值，若无法得到参数的信息，可作预实验或专业上公认的差值代替；总体标准差，常用预试的样本标准差来估计；第一类误差的概率()，既检验水准；检验效能1公式：n=22(t+t)2/2n为样本含量，为标准差；t取有显著性的t分布值，t0.05=1.96；t为无显著性的t分布值，1-为实验检验能力，动物实验一般取1-=0.80，t0.20=0.842；为处理组与对照组均值间的差异，可从预实验或文献资料库中获得。,有些实验单做一种动物还不够，应当重复做几种动物。这不仅可以比较不同动物的差别，而且可以在不同动物实验中发现新

40、问题，提供新的线索。如动脉粥样硬化的实验，不同动物在血管的结构、病变、-和-脂蛋白的比例以及胆固醇的水平各有不同，这样不仅可以比较一些不同动物病理变化，也可以根据这些不同的变化寻找生化指标与病变形成的关系，把实际工作推进一步。,由于不同种属动物有不同的功能和代谢特点，所以在肯定一个实验结果时最好采用两种以上的动物进行比较观察，其中一种应该是非啮齿类动物。尤其是动物实验结果要外推到人的实验，所选用的动物品种应不少于3种，而且其中之一不应是啮齿类动物。常用的生物序列是小鼠大鼠犬（小型猪或猴）。,小鼠,大鼠,犬,猴,小型猪,4、一致性原则：一个实验设计方案的均衡性好坏，关系到实验研究的成败。应充分发

41、挥具有各种知识结构和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高实验设计方案的均衡性。要求实验组和对照组除了处理因素不同之外，实验对象、实验条件、实验环境、实验时间、药品、仪器、设备、操作人员等等，均应力求一致。即：动物：品系、体重、年龄、性别、饲料和饲养方式等方面一致环境：实验室温度、气压、湿度、季节和时间等环境条件一致仪器：种类、型号、灵敏度、精确度、零点漂移、电压稳定性、操作步骤和熟练程度等方面一致药物：厂商、批号、纯度、剂型、剂量、注射容量和速度、酸碱度、温度、给药途径和给药顺序等方面保持一致。,5、弹性原则：即所谓空缺原则，指的是在时间分配上留有空缺。适当的空缺是非常必要的，只有这样才能

42、富有弹性的实施实验计划，并不断地调整好自己的实验进度。6、最经济原则：不论什么实验，都有它的最优选择方案，这包括在资金的使用上，也包括人力时间的损耗上，必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值，这个比值越大越好，当然是以你所拥有的实验条件为基础。,四、常用动物实验设计方法简介,1、单组比较设计：是指在同一个体上观察处理前后某种观测指标的变化。又称为自身对照设计。如果施与每个受试对象的处理是相互交叉的，又称为交叉设计。自身对照有3种形式：对每个观察单位进行两次观察，第一次观察不给处理，第二次观察给予处理，两次结果的差值作为实验效应对每个观察单位进行两次观察，第一次是处理A，第二次是处理B，也

43、以两次结果的差值作为实验效应将受试对象随机分为两组，首先第一组给予处理A，第二组给予处理B，之后再换成第一组给予处理B，第二组给予处理A。两组A处理的结果作为A的效应，两组B处理的结果作为B的效应，A与B进行比较，即交叉分组比较。此法的优点是能清除个体间生物差异，但不适用于在同一个体上多次进行实验和观察。还应注意有时阴性对照前后两次测量时一些指标也经常出现一定的差异（如体重、血压等），此时要注意环境因素的控制。,2、配对比较设计：指实验前将动物按性别、体重或其它有关因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对，配成若干对，然后将一对动物随机分配于两组中。两组动物的数量、体重、性别等情况基本相同，取

44、得均衡后进行实验，以减少误差及动物间的个体差异。动物实验中：常将种属、性别相同，年龄、体重相近的两个动物配成对子。适用于总体同质性差，对间同质性不高，对内同质性较好。优点：减少两组实验误差及动物间的个体差异。抽样误差较小、实验效率较高、所需样本含量也较小缺点：应考虑种属、品系、性别、年龄与体重、同父母、同胎次出生等因素对实验结果的影响。当配对条件未能严格控制造成配对失败或配对欠佳时，反而会降低效率。,例：为研究VitE缺乏饲料对大鼠肝脏中VitA含量(u/mg)的影响，选取同性别(雌、雄各半)、同月龄(断乳1个月)、同体重(50g+2g)等正常大鼠配成10对，对每对中每只大鼠按随机数字表(或抽

45、签)随机分配到给以正常饲料组和VitE缺乏饲料组，分饲条件相同的不同笼中，经1个月饲养后处死，按每对分别取肝脏，测得VitA含量(u/mg)如表。,3、完全随机设计；亦称单因素设计，是将每个实验对象随机分配在各组，并从各组实验结果的比较中得出结论。通常用随机数字表法进行分组。各组样本含量相等：平衡设计各组样本含量不等：非平衡设计优点：是设计和统计的处理都比较简单，即使各处理组例数不等也不影响试验结果的分析，抗数据缺失能力较强。但在例数较少时往往不能保证组间的一致性。缺点：只能分析一个因素，效率不高。对非实验因素缺乏有效控制，适用于实验对象同质性较好的实验设计。小样本时，可能均衡性较差，抽样误差

46、较大。对个体间同质性要求较高，在个体同质性较差时，完全随机设计并不是最佳设计。,例：为比较小鼠接种3种不同菌型伤寒杆菌(9D、11C、DSC1)后存活日数的差异，选择同品系、性别(雌、雄各半)、体重(土1s)、月龄(土2天)、生理精神状态、饲养条件等小鼠30只，依随机数字表随机分为3组，在相同条件下接种菌苗，后观察存活日数如下表。,4、随机区组设计；也称配伍组设计。是配对比较设计的扩大。将全部动物按体重、性别及其它条件等分为若干组，每组中动物体质条件相似，再将每个区组中的每一只动物进行编号，利用随机数字法将其分配到各组。配对设计的每一“对子”分别给予两种处理，而配伍组设计中的每一“配伍组”包含

47、多个受试对象，分别给予多种处理。适用于总体同质性差，部分同质性好。优点：每个区组内的k个受试对象有较好的同质性，因此组间均衡性也较好；比完全随机设计减少了误差，因而更容易察觉处理组间的差别，提高了实验效率。缺点是要求区组内实验单位数与处理数相同，抗数据缺失能力较低。若一个区组的某个动物发生意外，那么整个区组都得放弃，或不得已采取缺项估计。,例：有人用4种不同种系的未成年大鼠做实验，每一种以同窝雌性大鼠3只，随机分配注射3种不同剂量的雌性激素(mg/100g)后，在相同条件下称其子宫重量(g)，见表：,5、拉丁方设计：用r个拉丁字母排成r行r列的方阵，使每行每列中的每个字母都只出现一次，这样的方

48、阵叫r阶拉丁方，或rr拉丁方。这种分别按拉丁字母、行和列安排处理因素及影响因素的实验称为拉丁方实验。它必须是3因素试验，且3种因素各有r个水平。优点：可以大大减少实验次数，比配伍组设计更进一步，是双向的误差控制，尤其适合于动物和实验室实验。缺点是要求处理数必须等于拉丁方的行（列）数，一般的实验不容易满足此条件，而且数据丢失会增加统计分析难度。由于每种处理的重复数较少，对差别的估计可能不够精确。例：蛇毒的抑瘤实验：4x4拉丁方实验,1，3两列对调,2，3两行对调：基本方随机化,基本方,成份（峰）,剂量,瘤株,6、正交设计：是研究多因素试验的一种设计方法。其特点是利用一套规格化的表格正交表来安排实

49、验，适用于多因素、多水平、实验误差大、周期长等一类实验的设计。设计过程中只要根据实验条件直接套用正交表即可，而不需要另行编制。正交表在统计学书上都可查到。以L9（34）为例说明其意义及使用方法：L代表正交表，右下角9字表示这张表需安排9次实验。括号内3表示这张表使用于三水平的实验，指数4表示最多可以安排4个因素的实验。总的来说用这张表进行实验设计，最多可以安排4个因素，每个因素取3个水平，一共进行9次实验。,五、实验数据的处理与分析,（一）参数估计：实验数据的统计描述1、算术平均数：表示一组观察值（或变量）的集中趋势、中心位置或平均水平的指标。2、标准差：表示一组变量值离散程度（dispers

50、ion）的指标，均数与标准差结合能更全面地说明一组变量的分布情况。3、率：表示一定条件下某种现象实际发生数与可能发生数的比。4、构成比：又称构成指标，表示事务或现象内部各构部分的比重。常称百分比。,（二）假设检验：显著性检验方法1、计量资料的分析方法：t检验：生物学研究中，由于实验条件和研究对象的限制，有许多研究的样本容量很难达到30，因此常采用小样本平均数的t检验。u检验法：对于样本数大于30，且能获知总体方差时可采用u检验法。F检验：而对于单因素样本（水平数k3）或两个及两个以上因素的实验数据则必须采用F检验。,2、计数资料的分析方法；计数资料的显著性检验大部分采用2检验。根据研究目的不同