《微生物学教学课件》第四章微生物营养和培养基.ppt

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1、第四章微生物的营养和培养基,目 录,相关定义第一节 微生物的六种营养要素第二节 微生物的营养类型第三节 营养物质进入细胞的方式第四节 培养基,营养（Nutrition）指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能营养物(Nutrient)：具有营养功能的物质,第一节微生物的六种营养要素,一 微生物的物质组成二 微生物的六种营养要素,一 微生物细胞的物质组成,微生物的六种营养要素分别为碳源、氮源、生长因子、无机盐、水及能源,二 微生物的六种营养要素,1 碳 源,凡能提供碳元素的物质均称为碳源，分为有机碳源和无机碳源两种。,凡必须利用有机碳源的微生物称为有

2、机营养型（异养）微生物；凡必须利用无机碳源的微生物称为无机营养型（自养）微生物。,微生物的碳源谱,2 氮 源凡能提供氮元素的物质均称为氮源，有有机氮源和无机氮源之分。1）无机氮源氮气（N2）：大气的成分。固氮菌含固氮酶系统和能量交换系统，还原分子氮生成氨。N2NH3（根瘤菌及其他固氮微生物）无机氮化合物：NH4+、NO3-,2）有机氮源尿素：CO（NH2）2，一部分微生物可以转化其为氨参与代谢小分子含氮化合物：氨基酸、肽等大分子含氮化合物：蛋白质等黄豆粉、鱼粉、蚕蛹粉等常被作为工业培养基的N源,微生物的氮源谱,3 生长因子（Growth factor）微生物的正常代谢必不可少且不可能用简单的碳

3、源或氮源自行合成的有机物。如微量的氨基酸、维生素、核苷酸等。,维生素 有的微生物自己不能合成维生素，需要补充，主要是B族维生素、硫胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需添加适量的生物素。,1）生长因子的种类,氨基酸 有些微生物自己不能合成某种氨基酸，必须给予补充，如赖氨酸发酵所用的黄色短杆菌不能合成环丝氨酸，即环丝氨酸缺陷型菌株，在培养基中必须添加含环丝氨酸的氮源。可以通过豆饼水解液或毛发水解液来补充氨基酸。,碱基 嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因子。有些微生物不仅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能将补充的嘧啶和嘌呤结合在核苷酸上，还必须供给核苷酸，有的菌需补充卟啉或其衍

4、生物，还有的菌需供给（低碳）脂肪酸等。,实验及生产中主要通过加入酵母膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁等天然物质来提供生长因子。,2）常用提供生长因子的物质,3）根据对生长因子的要求，微生物可以区分为生长因子自养型、生长因子异养型、生长因子过量合成型等三种。链霉菌是VB12的过量合成型微生物阿舒假囊酵母是VB2的过量合成型微生物,4 无机盐 大量元素：P、S、Mg、Fe、K、Ca、Na 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co 主要作用：参与细胞组成或作为酶的辅助因子、调节渗透压、pH、氧化还原电位,无机盐的生理功能：,5 水 水为细胞内含量最多的成分。水的重要作用：细胞内的生物氧化需在水环境中进行；运

5、送物质需借助于水来完成；吸收热量而保护细胞；利用水中的H作为还原二氧化碳的还原剂,6 能源为微生物的生命活动提供最初能量，主要来自于营养物或辐射能。,能源供体,上节内容回顾,发酵液感染噬菌体后的变化微生物的六种营养要素生长因子的定义,第二节 微生物的营养类型,以能源及碳源的不同对微生物进行分类,根据碳源进行区分：有机营养型、无机营养型,根据能源进行区分：光能营养型、化能营养型,综合分类：光能自养（无机营养）型、光能异养（有机营养）型、化能自养（无机营养）型、化能异养（有机营养）型,一 光能自养型（Photoautotroph）,这一类微生物可以在完全无机的环境中生长，以CO2为碳源，以光为能源

6、，无机物为供氢体还原CO2合成细胞有机物质。,能源：自然光；碳源：二氧化碳；供氢体：无机物，如H2S；电子供体：Na2S2O3等 光合色素：菌绿素、叶绿素 沉积S的反应：CO2+2H2S-(CH2O)N+2S+H2O 代表菌：红硫细菌、绿硫细菌、蓝细菌,高等绿色植物和蓝细菌,CO2+2H2O CH2O+H2O+O2,光,叶绿素,光合细菌（绿硫细菌）,CO2+2H2S CH2O+H2O+2S,二 光能异养型(Photoheterotroph),这类微生物具有光合色素，能利用光做能源，以有机化合物为供氢体，还原CO2，合成细胞物质。,光能异养微生物能利用CO2，但必须在有机物存在的条件下，才能生长

7、，人工培养还需供给生长因子。目前已用这类微生物，如红螺菌来净化高浓度有机废水，这对处理污水、净化环境，很有发展前途。,能源：自然光；碳源：不以二氧化碳为唯一或主要碳源，主要需小分子有机碳源供氢体：异丙醇等简单有机物；,光合作用：CH3 CHOH+CO2丙酮（CH2O）H2O CH3若不要二氧化碳则需光能直接消耗小分子有机碳源代表菌：红螺菌（乙酸钠为碳源）、红假单胞菌,深红螺菌,2(CH3)2CHOH+CO2 2(CH3)2CO+CH2O+H2O,三 化能自养型（Chemoautotroph）,这类微生物在完全无机的环境中生长发育，以无机化合物氧化时释放的能量为能源，以CO2或碳酸盐为碳源，合成

8、细胞物质。这类细菌包括硫细菌、硝化细菌、氢细菌、铁细菌等，其中硫细菌和硝化细菌与生产密切相关。,能源：化学无机物；碳源：二氧化碳或碳酸盐；供氢体和电子供体：NH4+NO2-H2 Fe2+代表菌：亚硝化细菌（NH4+NO2-+ATP）硝化细菌（NO2-NO3-+ATP）硫细菌（H2SS+ATP）甲基微生物：利用甲基化合物 如：甲烷、甲醇、甲酸等代表菌：甲基单胞菌,亚硝酸细菌,2NH3+2O2 2HNO2+4H+能,CO2+4H+能 CH2O+H2O,如FeO硫杆菌可把FeO氧化成Fe3+，Fe氧化率达95100并放出能量 Fe2Fe3eQ 用氧化亚铁硫杆菌氧化黄铁矿时，可以生成硫酸和硫酸高铁，硫

9、酸高铁是强氧化剂和溶剂，可以溶解矿物，如溶解铜矿析出铜元素，用这类微生物来开矿冶金称为细菌冶金，是开采贫矿和尾矿的有效办法，用细菌浸出Fe的速度比完全氧化快5660倍。,这类微生物以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中产生的能量为能源，以有机或无机含氮化合物为氮源，合成细胞物质。该类微生物种类和数量最多，包括多数细菌，几乎所有真菌和原生动物。,四 化能异养型（Chemoheterotroph）,能源：有机物；碳源：有机物；供氢体：有机物；大多数的微生物都属于此类型。有的微生物在不同环境时的营养类型不同，如红螺菌 有光厌氧时：光能异养；有光有氧时：光能自养。二氧化碳+丙酮酸朊乳酶草酰乙酸,

10、营养类型,第三节 营养物质进入细胞的方式,细胞膜是控制营养物质进入和代谢物排出的主要屏障，细胞膜运送营养物质有4种方式，即单纯扩散、促进扩散、主动运送和集团移位。,一 单纯扩散（simple diffusion）通过物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲脂性的分子被动的通过（包括O2、CO2、乙醇、某些氨基酸）的一种物质运输方式。通过这种方式运送的物质主要有O2、CO2、乙醇和某些氨基酸等。浓度差驱使小分子进入膜，膜孔没有特异性，单孔的大小决定了外界物质是否能进入。,单纯扩散模式图,细胞膜外,细胞膜内,细胞膜,自由扩散,物质进入细胞的动力是细胞内外的浓度差。这种运输方式不消耗能量 没有特

11、异性，被运输物质不与膜上物质发生任何反应，物质不发生化学变化。,单纯扩散(simple diffusion)特点,二 促进扩散（facilifated diffusion）溶质在运送过程中，必须借助存在于细胞膜上的底物特异载体蛋白（或称透性酶、移位酶、移位蛋白），但不消耗能量的一类扩散运送方式。如酿酒酵母对各种糖、氨基酸和维生素的吸收；大肠杆菌对甘油的吸收高浓低浓,促进扩散(facilitated diffusion)特点,物质运输动力是细胞外的浓度差。运输过程不消耗能量。有膜载体参加，膜载体（渗透酶）有特异性。运输葡萄糖的载体只运输葡萄糖。这种运输方式多发生在真核微生物，原核生物少见。,三

12、主动运输（active transport）指一类需提供能量（来自于ATP、质子动势或“离子泵”等）并通过特异性载体蛋白的构型变化，而使膜外环境中低浓度的溶质进入膜内的一种运送方式。主要用于无机离子、有机离子及一些糖类等运输。,主动运输模式图,细胞膜,细胞膜外,细胞膜内,恢复原构象,移位,再循环,结合,构象改变,被运送的物质可逆浓度梯度进入细胞内 要消耗能量，必需有能量参加。有膜载体参加，膜载体发生构型变化 被运送物质不发生任何变化。,主动运输特点,四 集团移位（group translocation）指一类既需特异性载体蛋白又需能量的物质运送方式，且溶质在运送过程前后发生分子结构的变化。主要

13、运送葡萄糖、果糖、甘露糖、核苷酸、丁酸和嘌呤等物质 葡萄糖：运送一分子葡萄糖需消耗1个ATP。依靠磷酸烯醇氏丙酮酸己酸磷酸转移酶系统1）PEPHPr丙酮酸P-HPr2）P-HPr糖糖PHPr,在酶的作用下HPr被激活,在酶的作用下P-HPr将磷酸转移给糖,Group Translocation,基团移位的特点：需要磷酸酶系统进行催化 被运输的物质发生化学变化，被磷酸化 需要能量,第四节 培 养 基,一 培养基的定义二 配制培养基的原则和方法三 培养基的种类,培养基（medium or culture medium）：一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料,一 培养基的定义,二

14、 配制培养基的原则和方法,（一）四个原则 1 目的明确 不同用途的培养基成分要求不同 1）种子培养基：营养成分宜丰富些 C/N 低些 2）代谢产物的发酵：C/N 可以高些,2 营养协调水C能源N源P、SK Mg生长因子C/N：营养程度的指标之一。微生物培养基中所含的碳原子的摩尔数与N原子的摩尔数之比,微生物在环境中的营养物质的C/N一般为25:1左右，其中真菌要求的C/N比较高，而细菌则需要C/N较低。,3 物理化学条件适宜1）根据微生物对pH要求来调节培养基的pH范围不同微生物的最适pH要求：细菌 7.0-8.0 放线菌 酵母菌 3.56.0 霉菌,调节培养基pH的方法：a 内源调节pH：磷

15、酸缓冲溶液及CaCO3 K2HPO4:KH2PO4=1:1(pH 6.07.6)b 外源调节：不断加入酸液(稀盐酸）和碱液（NaOH溶液）,2）渗透压和水活度渗透压等渗溶液适宜微生物的生长；高渗溶液使细胞发生质壁分离；低渗溶液使细胞吸水膨胀,实际上微生物细胞内的渗透压要高于环境的渗透压,水活度水活度aw（water activity）微生物可实际利用的自由水或游离水的含量 awP/P0=ERH/100 同温同压下，某溶液的蒸汽压（P）与纯水蒸气压（P0）之比,各种微生物生长繁殖范围的aw值在之间,3）氧化还原电势,各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求不同好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0

16、.1V以上的环境中均能生长)。厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵,对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度 培养基中常用的还原剂：巯基乙醇、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等,4 经济节约：1）以粗代精；2）以野代家；3）以废代好；4）以简代繁；5）以烃代粮；6）以纤代糖;7）以氮代朊;8）以国代进；,（二）配制培养基的四种方法：1、生态模拟；2、查阅资料；3、精心设计；4、实验比较,上节内容回顾,根据能源和碳源的不同对微生物的分类营养物质进入细胞的四种方式的特点培养基的定义配制培养基的原则,三 培养基的种类,一）根据对

17、培养基成分的了解程度来区分1 天然培养基 是指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物配制的培养基。这一类培养基营养成分较为复杂，难以说明其确切化学组分。用于基本培养基、种子培养基或发酵培养基,2 组合培养基：（又称合成培养基、综合培养基）纯化学试剂配成，确切知道各成分的量。用于代谢、生理、遗传、育种、菌种鉴定和生物测定等定量要求较高的工作上。3 半组合培养基 指一类以化学试剂为主，同时加有某种或某些天然成分的培养基。,培养基配方举例细菌培养基营养肉汤（nutrient broth)：牛肉膏 3g；NaCl 5 g；蛋白胨 10g；水 1000ml；pH 7.27.4放线菌培养基高氏1号：可溶性

18、淀粉 20g；KNO3 1g;K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g NaCl 0.5 g;FeSO47H2O 0.01g 水 1000ml;pH 7.27.4,霉菌培养基土豆培养基：土豆 200g,蔗糖 20g,琼脂 20g,蒸馏水 1000mL pH 自然酵母菌培养基麦芽汁培养基 大麦阴暗处发芽，磨碎后65水浴锅中糖化，过滤后稀释为5-6波美度左右的糖液，调pH6.4左右，加入琼脂制成固体培养基,(二）根据培养基的外观状态分类,1 液体培养基：适宜于摇床培养及工业生产。2 固体培养基：1）凝固培养基，又称固化培养基，向液体培养基中加入适量的凝固剂配制而成。常见的凝固剂有琼脂及明胶，用

19、量为琼脂1.52、明胶512。另外，还有海藻酸胶、脱乙酰吉兰糖胶和多聚醇F127可以作为凝固剂。2）非可逆性凝固培养基，添加血清或无机硅胶而成。3）天然固体培养基 4）滤膜（醋酸纤维薄膜）：用于菌种的分离、鉴定、菌落计数、检验杂菌、选育、菌种保藏等,理想凝固剂应具备的条件,1.不被微生物分解、利用、液化；2.不因消毒灭菌而被破坏；3.在微生物的生长温度内保持固态；4.凝固点的温度对微生物无害；5.透明度好，粘着力强,2 半固体培养基：添加少量的凝固剂，如0.5琼脂而成。适用于穿刺培养、噬菌体效价测定等。4 脱水培养基：又称脱水商品培养基，指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入水分

20、并加以灭菌即可。,（三）按培养基的功能分：1 基本培养基：用于一般微生物的培养2 选择性培养基：根据某种微生物的特殊要求或其对某化学、物理的抗性而设计的培养基，其功能是使劣势菌成为优势菌。抑制条件包括：pH、渗透压等以及抑制剂（染料、抗生素、脱氧胆酸钠）,选择性培养基的举例 酚抑制霉菌和细菌从而得到放线菌；青霉素或链霉素抑制放线菌和细菌从而得到酵母菌和霉菌；结晶紫抑制革兰氏阳性菌得到革兰氏阴性菌。亚硫酸铋可以抑制革兰氏阳性菌与大多数革兰氏阴性菌的生长，可得沙门氏菌。,马丁氏琼脂培养基（分离真菌用）葡萄糖 10g蛋白胨 5gKH2PO4 1gMgSO47H2O 0.5g1/3000孟加拉红（玫瑰

21、红水溶液）100ml琼脂 20gpH 自然蒸馏水1000ml112灭菌30分钟临用前加入0.03链霉素稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30g,3 加富培养基：加入某些特殊的营养物，如血、血清、动、植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求苛刻的微生物，或用以富集和分离某种微生物.,支原体培养基：月示胨 10.0 蛋白胨 1.0 牛肉浸粉1.0 牛心浸粉 4.0 氯化钠5.0 葡萄糖 5.0 酵母浸粉 0.02 苯酚红2.0 L-精氨酸2.0琼脂12pH值7.70.1,如富集自生固氮菌用的甘露醇培养基；添加纤维素的培养基可以富集纤维素分解菌,4 鉴别

22、性培养基：培养基中加有能与某一微生物的无色代谢物产生显色反应的指示剂，以鉴定该种微生物的存在。如：伊红美兰乳糖培养基等。,伊红美兰乳糖培养基(Eosin Methylene blue),G+菌受抑制,G-菌,能发酵乳糖产酸,不发酵乳糖不产酸，菌落无色透明,产酸力强，菌落呈紫绿色金属光泽,产酸力弱，菌落棕色,EnterbacterKlebsiellaHafniaSarrdia,ProteusSalmonellaShigella,E.coli,试样,EMB在鉴别各种肠道杆菌中的作用：,EMB(Eosin Methylene Blue),Figure 14.Left:Escherichia coli

23、 cells.Right:E.coli colonies on EMB Agar.,培养基名称 加入化学物质微生物代谢产物培养基特征性变化 主要用途酪素培养基 酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鉴别蛋白酶生产菌株明胶培养基 明胶 胞外蛋白酶明胶液化 鉴别蛋白生产菌株淀粉培养基 可溶性淀粉胞外淀粉酶淀粉水解圈鉴别产淀粉酶菌株H2S试验培养基醋酸铅H2S 产生黑色沉淀 鉴别产H2S菌株糖发酵培养基溴甲酚紫乳酸、醋酸、丙酸等由紫色变成黄色鉴别肠道细菌油脂培养基 食用油、土温、胞外脂肪酶由淡红色变成深红色 鉴别产脂肪酶细菌 中性红指示剂,枸橼酸利用试验,大肠杆菌：产气杆菌：+,有的培养基可以将选择性与鉴别性集于一体，如在培养基中加入7.5%NaCl、甘露糖醇和酸碱指示剂，金黄色葡萄球菌可耐高浓度盐，且利用甘露糖醇产酸。,