《医学遗传与胚胎发育》dna复制与修复整合课程.ppt

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1、DNA的复制与修复,第一节 参与DNA复制的一些酶类和蛋白质,2,一、大肠埃希菌DNA聚合酶（原核生物）,DNA聚合酶多功能酶 5 3外切酶 3 5外切酶 5 3聚合酶单链多肽 大小二个片段切除RNA引物，填补空缺损伤后修复,DNA聚合酶与多功能酶 5 3聚合酶 3 5外切酶 不对称二聚体单体1-前导链/单体2-随从链DNA 复制的主要酶 高续进性 高聚合酶活性 高产物真实性,4,5,3 5 5 3 外切酶 聚合酶,N,C,5 3外切酶,小片段,大片段（klenow片段）,切除RNA引物损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,DNA聚合酶（DNA Polymerase）Kornberg酶 DNA

2、指导的DNA聚合酶（DNA-Directed DNA Polymerase,DDDP）,聚合功能,6,5,3,5,3,5 3外切酶,3 5外切酶,7,5 3聚合酶,5,5,3,3,模板链,合成链,DNA聚合酶全酶（DNA Polymerase holoenzyme）,10种不同亚基组成,9,核心聚合酶亚基复合物,(rho),(delta),(epsilon),(psi),(Tau),(sigma),(theta),(chi),二、真核生物的DNA聚合酶,11,三、解链、解旋酶类,DNA解链酶（helicase）DNA结合蛋白(SSB）,解开DNA双链每个bp消耗2个ATP与单链DNA结合,维持

3、单链状态(“镇纸”)使其不受核酸酶水解避免单链DNA自身发夹螺旋形成使前端螺旋易解开,12,四、拓扑异构酶,13,五、引发体（primosome）,蛋白质DnaADnaBDnaCDnaG（引物酶）,结合到DNA双链复制起始部位(需ATP)解链酶的作用辅助DnaB结合到复制起始点合成RNA引物,14,RNA引物的合成和复制的起始必需的,15,六、DNA连接酶,催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成,16,3OH,5,5,3,OO-P O O-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,OO P O O-,5,3,缺口封闭,缺口填补:连接双股DNA分子中一链的缺口双链DNA分子

4、中双链的缺口不能连接二分子单链DNA,17,18,应用:1.岗崎片段之间的连接.2.DNA损伤修复中的连接.3.一种重要的工具酶:限制性内切酶切割后形成的粘性末端或 平头末端的连接.,第二节 DNA复制的过程(起始、延长、终止）,确定复制的起始点解开双链DNA,提供单链DNA模板，形成复制叉RNA引物的形成DNA链合成及延长复制的终止,19,一、原核生物的DNA复制的基本过程,20,大肠埃希菌复制起始点oriC的结构,原核生物双向复制（型复制）,23,DNA聚合酶为不对称二聚体：一个作用于前导链另一个作用于随从链(loop),图12-14,25,3,5,5,3,26,二、真核生物的DNA复制的

5、基本过程,真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）,28,29,30,端粒的形成,4.以延长的DNA单链为模板,3-OH为引物合成富含C的互补链,第三节 DNA复制的几个基本原则（特点）一、半保留复制（semiconservative replication）,模板原则特点,亲代的DNA双链，每股链都可作为模板按碱基配对原则指导新链的合成合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链,34,35,亲代DNA,子代,子代,半保留复制,新合成 的链,二、半不连续复制（semidiscontinuous replication）1、体内仅存在5 3的D

6、NA聚合酶2、前导链与随从链（岗崎片段）,37,38,半不连续复制：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3 5方向的母链作为模板指导新的链以5 3 方向连续合成，另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成10002000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。,39,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,40,前导链（leading strand）：DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，指导新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）,41,随从链（l

7、agging strand):DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成，10002000个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。（复制方向与解链方向相反),42,岗崎片段（Okazaki）：DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成10002000个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。,三、RNA引物,DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上聚合需要具3-OH的引物,RNA聚合酶能催化两个游离的NTP在DNA模板上聚合提供3-OH引物引物最后要被DNA聚合酶除去，缺口由该酶补满，再

8、由连接酶连接,43,减少突变，提高DNA复制的真实性,44,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,四、复制的真实性DNA的半保留复制遵守严格的碱基配对规律RNA引物DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能复制出错是有即时的校读功能(3 5外切酶功能）DNA损伤的修复机制,45,46,第四节 DNA的损伤与修复,一.造成损伤的原因,自发因素物理因素化学因素,细胞代谢、复制错误紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/线）亚硝酸盐 C U5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂羟胺 C-A,47,G,G,羟胺,二、DNA损伤类型,48,Oxidation

9、（氧化）Alkylation(methylation)（烷化）Hydrolysis（水解）Bulky adduct formation（加合物形成）Mismatch（错配）,49,与基因损伤的区别,1.Direct reversal repair,MGMT,methyl guanine methyl transferase,三.修复机制,2.Base excision repair,着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）：是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶异常造成DNA修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。诊断要点：幼年发病，常有同胞发病

10、史；患儿生后皮肤和眼对日光敏感，畏光，在面部等暴露部位出现红斑，褐色斑点及斑片，伴毛细管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕。皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌，鳞癌及恶性黑素瘤。病情随年龄逐渐加重，多数患者于20岁前因恶性肿瘤而死亡。,一、缺乏UV特异核酸内切酶 着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）,53,碱基修复识别酶：（1）一类DNA糖苷酶，各具特异性 e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（由C突变而来）（2）作用：识别-DNA中改变的碱基水解-改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键 改变的碱基脱落,54,DNA碱基的组成为何是“T”？DNA中的C容易突变成U尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（由C突变而来）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U所以DNA中U甲基化/耗能生成TDNA碱基中T的存在，增加遗传信息的稳定性RNA中的U：数量多/半衰期短/经济,3.Recombinant repair,Single-strand breaksDouble-strand Breaks,4.SOS修复,56,57,