黄曲霉毒素的检查方法.ppt

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1、黄曲霉素的检测方法,王慧,由于黄曲霉素在自然界的广泛存在和对人、畜等生物的巨大危害性（主要为致癌性，WHO将其列为自然界最强的三大致癌物之一），国际上将其纳入到严格控制的有害生物名单之中。农产品黄曲霉素含量是国际上食品卫生和农产品贸易中的必检指标。在我国加入WTO后，黄曲霉素（A flatoxin）也常常成为某些国家和组织限制我国农副产品出口的绿色壁垒，我国已连续多次因为黄曲霉素被检出而遭受农产品贸易损失。基于上述这些原因，我们必须加强农副产品及饲料产品中各型黄曲霉素检测的工作。,世界公认的三大致癌物：黄曲霉菌、三四苯并芘、亚硝酸盐,黄曲霉毒主要存在于发霉的粮、油、花生中，它是黄曲霉及寄生曲霉

2、的代谢产物，毒性极强，可致肝癌，由于黄曲霉素是一种热稳定的化学物质，所以在烹调过程中不易破坏。预防措施主要是防霉。但如果食品已霉变产毒，则应采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾轧法及水搓法；植物油可用加碱去毒法等。目前已分离鉴定出18种，主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 以及由B1、B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M1、M2 等，B1为毒性及致癌性最强的物质。其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍,被列入严管的特剧毒物质！,中药材的采收、加工、销售、直到使用需要一段相当长的时间，如果储存环境不合理，会造成药材或饮片发霉变质，特别是含油脂比较丰富的种子类药材，更容易发生变

3、质，产生大量黄曲霉素。2010版中国药典，修改增加了很多项目，尤其是增加了安全性控制指标，其中首次增加黄曲霉素控制。,2010版药典规定每1000g含黄曲霉素B1不得过5g，含黄曲霉素G2、黄曲霉素G1、黄曲霉素B2和黄曲霉素B1的总量不得过10g。在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、胖大海、陈皮等五个品种的黄曲霉素检查。,测定方法,测定黄曲霉毒素B1的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、荧光光度法、酶联免疫吸附测定法、免疫亲和层析柱-高效液相色谱法、免疫亲和层析柱-荧光光度计法等,薄层分析法(TLC),最经典、最常用，至今仍为一些检测机构所用，也是一种国标方法 原理是用适宜的萃取溶剂将黄曲霉

4、素从试样中萃取出来，经柱层析（它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法）净化后，再在薄板上展开后分离，利用黄曲霉素的荧光特性,根据荧光斑点的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分很复杂的试样要双向展开，才能获得较高的灵敏度TLC法设备简单，检测费用低，但操作繁琐费时，萃取和净化效果不理想，灵敏度差，对操作人员的身体健康存在较大程度的危害,液相色谱法(HPLC)原理是在高效液相色谱仪上添加柱后衍生系统分离，再用荧光检测器测定。当前，该方法大多用免疫亲和柱来净化分离，净化效果优异 该法能准确地分离不同种类的黄曲霉素，检测速度快且定性与定量准确，检测限低，

5、可作为仲裁法使用，但仪器设备价格昂贵前处理方法相对繁琐，若用到免疫亲和柱则会使试样检测费用增加，对操作人员的身体健康仍存在一定的危害,柱后衍生：利用衍生反应使被测物与相应的试剂分析反应，以改变其物理或化学性质，使其被检测到。例如将发色基团或荧光基团键合到样品中去，多极放大检测灵敏度柱后衍生系统：有碘衍生化法、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法免疫亲和柱：基于抗原抗体反应，特异性抗体连接在柱体内，选择性吸附样品中的待检物，杂质不被吸附，流出柱外，柱上结合的目标物再被特定的洗脱液洗下来，可以用于液相色谱(HPLC)分析或者ELISA含量测定，是一种高效的前处理柱。,原理是根据抗体

6、和抗原之间特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度 ELISA法将已知的待测AFB1抗原(或抗体)吸附于固定载体的免疫吸附剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质,加入酶标记的AFB1 抗体(或抗原)与样品中的待测物(抗原或抗体)发生特异免疫学反应，形成酶标记的抗原一抗体复合物，洗涤后，加入酶底物，进行显色反应，通过颜色的深浅来测定AFB1抗原或抗体的含量。,酶联免疫法(ELISA),ELISA法相对于HPLC具有特异性强、干扰小，样品的预处理简便，且快速、灵敏、高效等特点，而且回收率高，提取方法简单，可以进行定性和定量测定，并且对设备装置的投资比HPLC降低了许多，大大节约了测试

7、的成本，因而ELISA已广泛用于食品中黄曲霉毒素的测定。,一种常用的国标方法原理是利用黄曲霉素各种毒素的荧光特性，用荧光光度计测定样品中黄曲霉素的含量。大致过程是：试样先经甲醇水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉素特殊抗体的免疫亲和柱净化（生物免疫学原理，此抗体对黄曲霉素具有专一识别功能），黄曲霉素键合在免疫亲和小柱的抗体上，用蒸馏水将柱上的杂质除去后，以甲醇将目标化合物洗脱下来，加显色剂于专用的荧光光度计中测定样品中的黄曲霉素含量该方法对检测人员身体健康无危害,检测速度迅速，灵敏度高，适用于大量试样检测，且定量准确，但检测费用较高，需要配置专用设备，且不能对单一的毒素进行检测,荧

8、光光度法(IAC/SFB),几种黄曲霉素检测方法的特点,免疫亲和层析净化高效液相色谱法,试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用是目前采用较多的一种方法 这些新方法新手段的快速应用 为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地适应了不同的检测目的和要求,免疫亲和层析净化荧光

9、光度法,黄曲霉毒素速测仪 农业部油料及制品质检中心中国农业科学院油料作物研究所根据 GB/T18979-2003研制成042NYART型黄曲霉毒素速测仪,本仪器采用的是免疫亲和层析净化荧光光度法 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去.以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)总量。该方法准确、简单、快速、安全。,毛细管电泳法(CE),是一种新发

10、展起来的分析黄曲霉素的方法 该方法与激光减弱荧光检测器(LIF)连用可很好地提高灵敏度等用毛细管电泳激光减弱荧光检测器测定AFB1、AFB2和 AFG1、AFG2，取得了较为理想的分离效果，其中对AFB2的测定最为灵敏,但CE法的成本较高，操作复杂，不适宜在试样检测中广泛应用,生物传感器法,是使用固定化技术将具有分子识别能力的生物活性物质与物理化学换能器结合，可以用来探测生物体内外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。其中利用分子间特异亲和性制备的亲和型生物传感器为免疫传感器。根据能量转换器所传导的物理或化学信号的不同,免疫传感器又可分为电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电晶体免疫传感器等 由于生物传感器具有选择性高，响应快操作简单携带方便和适合于现场检测等优点，因此各国科研工作者正积极探索研制新型生物传感器用于检测黄曲霉素。,研,