项目三细胞化学染色.ppt

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1、项目三 细胞化学染色,细胞学和化学相结合而形成的一门科学，是以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种特定的化学成分(如酶类、酯类、铁、蛋白质、核酸等)，作定性、定位、半定量分析的方法。,定义,第一节 概 述,细胞化学染色,原 粒,原 单,原 淋,POX染色,+,弱+,-,（一）固定固定有物理法与化学法，物理法为干燥和火焰固定，化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,（二）显示 1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物

2、酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。5、金属沉着法其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）细胞化学定量粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。积分法，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的

3、强弱。,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,酯 酶 染 色（SE、NSE）,苏 丹 黑 染 色（SBB）,常用细胞化学染色,糖原染色（过碘酸-雪夫反应）（PAS）,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）,酸性磷酸酶染色（ACP）,铁 染 色,过氧化物酶染色（POX）,过碘酸-雪夫（PAS）反应,【原理】含乙二醇基的多糖 过碘酸 双醛基+无色品红（-CHOH-CHOH）（-CHO-CHO）(雪夫试剂)紫红色化合物（定位于胞浆中）称过碘酸-雪夫（PAS）反应，以前又称为糖原染色,【正常血细胞的染色反应】,【正常血细胞的染色反应】,1、粒系：原粒（-），以后阶

4、段（+）且越成熟阳性越强，阳性率达67.2，嗜酸（浆）、嗜碱（颗粒）（+）2、淋巴系：原淋（+）或（-），成熟（+）阳性率10-50，多20；3、红系：呈（-）；4、巨核细胞：呈强（+）。5、单核系：分化差原单（-），其他弱（+）。,过碘酸-雪夫（PAS）反应,正常血细胞PAS染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（+）3.中性中幼粒细胞（+）4.中性晚幼粒细胞（+）5.中性杆状核粒细胞（+）6.中性分叶核粒细胞（+）7.嗜碱性粒细胞（+）8.嗜酸性粒细胞（+）9.单核细胞（）10.淋巴细胞（+）,【临床意义】,1、鉴别M6与巨幼细胞性贫血：M6：幼红细胞 PAS 强（+），积分率明显。巨幼贫

5、、再障：幼红细胞（-）。2、鉴别三种急性白血病 急粒：（-）。急淋：强（+），急单：（+），强弱不定。3、鉴别戈谢病和尼曼-匹克病 戈谢细胞 强（+），尼曼-匹克细胞呈（-弱+）。,过碘酸-雪夫（PAS）反应,糖原染色（PAS染色）A、AML-M6（+）；B、MA（-）,PAS染色A、CLL；B、ALL原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性 幼稚红细胞 阴性,【原理】,偶氮偶联法：血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（pH 5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,酸性磷酸酶（ACP）染色,【原理

6、】,抗酒石酸酸性磷酸酶染色：用相同方法制备两份基质液，一份加入适量的L-酒石酸（左旋酒石酸）,另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸，两张涂片均呈阳性；如不耐L-酒石酸，不加L-酒石酸的涂片呈阳性反应，而加L-酒石酸呈阴性反应。,酸性磷酸酶（ACP）染色,【正常血细胞的染色反应】,粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性。,酸性磷酸酶（ACP）染色,【临床意义】,1.诊断多毛细胞白血病 多毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被L-酒石酸抑制。CLL的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色

7、也可呈阳性，但可被L-酒石酸抑制。2.鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞 前者阳性，不被L-酒石酸抑制；后者阴性。3.T淋巴细胞和B淋巴细胞的鉴别 T淋巴细胞ACP呈阳性反应；B淋巴细胞ACP呈阴性或弱阳性反应。,酸性磷酸酶（ACP）染色,多毛细胞白血病酸性磷酸酶染色多毛细胞呈阳性反应,酯 酶 染 色,根据酯酶特异性高低分为:,特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶),非特异性酯酶,pH值不同,酸性酯酶(酸性-醋酸萘酚酯酶),碱性酯酶(-丁酸萘酚酯酶),中性酯酶,-醋酸萘酚酯酶,醋酸AS-D萘酚酯酶,【原理】,血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质

8、液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,【临床意义】,1.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阳性或阴性。2.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性。3.急性单核细胞白血病 原始单核及幼稚单核细胞几 乎呈阴性。4.急性粒-单核细胞白血病 原始粒细胞及早幼粒细胞 呈阳性，原始单核及幼稚单核细胞呈阴性。5.急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病 白血 病细胞均呈阴性。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)

9、染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统 分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好 的呈阳性，自早幼粒细胞至成熟中性 粒细胞均呈阳性。嗜酸性粒细胞呈阴 性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。2.单核细胞系统 绝大多数为阴性。3.其他细胞 如淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核 红细胞、血小板等均呈阴性；肥大细胞呈阳性。,急性粒细胞白血病（M2a）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色1.原始粒细胞，呈弱阳性；2.幼稚粒细胞，呈强阳性；3.中性杆状核粒细胞，呈强阳性,【原理】,血细胞内的-醋酸萘酚酯酶在pH中性的条件下，水解基质液中的-醋酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质

10、内酶所在的部位。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【正常血细胞的染色反应】,1.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。2.粒细胞系统 各期粒细胞多数呈阴性，少数呈弱 阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【正常血细胞的染色反应】,3.淋巴细胞系统 各期淋巴细胞多呈阴性，少数呈弱 阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。4.其他细胞 巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不 能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱 阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆 细胞呈阴性。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NA

11、E)染色,【临床意义】,1.急性单核细胞白血病 单核系细胞多呈阳性，阳性 反应能被氟化钠抑制。2.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。3.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性，阳 性反应不能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【临床意义】,4.急性淋巴细胞白血病 原始淋巴细胞及幼稚淋巴细 胞呈阴性或阳性，阳性反应 不被氟化钠抑制。5.急性粒-单核细胞白血病 原始粒细胞呈阴性至阳 性，阳性反应不被氟化钠 抑制；原始单核及幼稚单 核细胞呈阳性，单核系阳 性反应能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,A图：急性单核细胞白血病-N

12、AE染色 原始、幼稚单核细胞多呈强阳性,B图：急性单核细胞白血病-NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）,A,B,【原理】,血细胞内的-NBE在pH碱性条件下，水解基质液中的-丁酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,【正常血细胞的染色反应】,1.粒细胞系统 各阶段粒细胞呈阴性。2.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性，幼稚单核及单核细胞呈阳性，阳 性反应能被氟化钠抑制。3.淋巴细胞系统 T淋巴细胞、非T非B淋巴细胞可呈 阳性

13、，B淋巴细胞呈阴性。4.其他细胞 巨核细胞、有核红细胞、浆细胞呈阴 性或弱阳性；组织细胞也可呈阳性，但不被氟化钠抑制。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,【临床意义】与-NAE染色的临床意义相同。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,【原理】,血细胞中的酸性-醋酸萘酚酯酶在pH弱酸性(pH 5.8)条件下，可水解基质液中的-醋酸萘酚，产生-萘酚，进而与重氮盐六偶氮付品红形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,【正常血细胞的染色反应】,1.单核细胞系统 单核系细胞常呈弥散型强阳性，阳性反应可被氟化钠抑制。2.淋巴细胞系统 T淋巴细胞呈阳性，而B淋巴细胞 多数呈阴性。3.其他细胞 粒系细胞一般为阴性或弱阳性，但此 反应不被氟化钠抑制；红系细胞、巨 核系细胞含量较少。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,【临床意义】,1.可粗略地鉴别T、B淋巴细胞 2.鉴别其它急性白血病细胞类型同-NAE染色。3.多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病细胞多为阳性；恶性组织细胞病呈强阳性；霍奇金淋巴瘤网状高铁红细胞(R-S细胞)呈阳性。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,四种常见类型急性白血病的染色结果,常用细胞化学染色与急性白血病亚型诊断思路,