限制酶精美生物医学.ppt

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1、基因操作技术的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,看书找答案,1、核酸酶分哪两种，有什么差别？2、限制性核酸内切酶分几种，哪种最常用，为什么？3、DNA连接酶的作用是什么，哪两种较常用？4、大肠杆菌DNA聚合酶的种类和作用,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割,A 用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,一、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d

2、株中分离出,Hind II和Hind III,一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5磷酸二酯键。,核酸酶分为：外切核酸酶【从一头开始，顺序切断】内切核酸酶【能识别特定序列切断】内切酶生理意义：分解外来DNA，保护自身DNA,二、限制性核酸内切酶的类型及其主要特性,特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白 质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中,I 型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5端至少1000bp不是（随机）无用,II 型限制酶和修饰酶分开单一成分 Mg2+位于识别位点上

3、 是非常有用,III 型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3端24-26bp处是用处不大,限制性核酸内切酶,三、限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,分离顺序：同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,四、影响限制性核酸内切酶活性的因素,1、DNA样品的纯度：,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,2、DNA样品的甲基化程度：,3、核酸内切酶的缓冲液性质,与II型核酸内切酶

4、有关的几个概念,粘性末端 cohesive ends：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 Blunt end：在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。,带5P端的黏性末端,带3OH 和5P端的平末端,（一）DNA连接酶的发现,首个DNA连接酶(ligase)1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码的。1970年，发现了T4 DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。,二、DNA连接酶,（二）常用的DNA连接酶,E.coli DNA连接酶：连接具互补碱基

5、黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。,（三）T4 DNA连接酶连接反应的条件,影响连接效率的因素有：A.温度（通常在4-15）B.ATP的浓度(10ML-1)C.连接酶浓度（平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多，一般平末端大约需12U，黏性末端仅需 0.1U）D.反应时间（通常连接过夜）E.插入片段和载体片段的摩尔比（1151）,三、DNA聚合酶,催化合成DNA的酶特点：不能自行从头合成DNA链，必须有一个RNA引物分类:大肠杆菌DNA聚合酶T4DN

6、A聚合酶T7DNA聚合酶Taq DNA聚合酶反转录酶,（一）E.coli DNA聚合酶 1.E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复：具35和53外切酶活性 pol II 参与DNA修复：具35外切酶活性 pol III 参与DNA复制：具35和53外切酶活性,2.E.coli pol 的特点,1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性 在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其大片段称为Klenow片段,具35外切酶活性2）聚合酶活性，53,要求3-OH引物和模板DNA3）外切酶活性,（二）T4 DNA聚合酶 1.特点：53聚合酶活性；35外切酶活性【对单链DNA强】2

7、.用途：制备高比活性探针,（三）Taq DNA聚合酶 1.特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性,2.用途,主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍,四、其它DNA修饰酶,磷酸酶和T4多聚核苷酸激酶DNA酶（DNase I）RNA酶（RNase）末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）,一、DNase I 1.特点：具内切酶活性，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg 2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值2.用途 1)切口移位，制备DNA探针 2)

8、制备RNA样品时除去DNA分子 3)基因突变时产生切口,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,RNase,RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。,核酸修饰酶,末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,外源基因不易自己进入细胞 进入后不能自我复制二、什么是载体（vector）？携带外源目的基因；进入宿主细胞；进行扩增和表达的具

9、有运载能力的DNA三、分类克隆载体【扩增】；表达载体【表达外源基因】,一、为什么要用载体？,B 用于基因克隆的载体,四、作为载体的DNA分子必须具备条件：,1.有复制子，至少有一个复制原点，能自主复制或整合到染色体DNA上随其复制而同步复制。2.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段插入载体DNA分子。,克隆位点【外源DNA进来的座位】克隆位点就是限制酶的识别位点【方便剪开载体，和外源DNA粘到一起】,A、一个载体，一种限制酶识别位点只有一个B、位点都在非必需区，剪开也不影响载体本身的复制。,3.必须具有用于选择克隆子的标记基因（1）抗性标记基因：抗生素抗性、重金属抗性(Cur，Znr)、代谢抗

10、性(TK，抗除草剂基因)（2）营养标记基因:主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因（3）生化标记基因(其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ),常用的遗传标记基因 1)氨苄青霉素抗性基因（Ampr）2)四环素抗性基因（Tetr）,Ampr抗性基因编码一种-内酰胺酶，可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力,五、载体的种类,根据来源可分为：质粒载体 噬菌体载体 大分子DNA克隆载体 病毒载体,（一）质粒载体,大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成，是应用最广的载体。,质粒,质粒的基本特征,质粒是能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分

11、子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型,严紧型复制控制的质粒,松弛型复制控制的质粒,质粒,质粒的构建,理由：天然存在的野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数野生型质粒构建的,pSC101 四环素抗性标记基因 Tetr,ColE1 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,常

12、用的质粒载体,是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19,理想质粒载体应具备特点：,1.松驰型复制子 复制子（replicon）是质粒自我增殖所必需2.几个单一的酶切位点（或多克隆位点）以便目的DNA片段插入,一、质粒载体,一、质粒载体,3.插入失活的筛选标记一般应具有两种抗菌素抗性标志如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等4.分子量相对较小和较高的拷贝数5.缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNA,一、质粒载体(plasmid vector),（一）pBR322质粒载体,（二）pUC质粒载体系列,（一）pBR322质粒载体,pBR322载体是最早被

13、广泛应用克隆的载体之一，至今尚在使用。pBR322载体的组成：复制起始位点（ori）AmprTetr,一、质粒载体,p代表质粒;“BR”代表两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首；“322”是实验编号,pBR322质粒载体和特点,1.带有一个复制起始点（ori）2.抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记3.数个单一的限制性酶切位点 当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活,一、质粒载体,4.较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。5.较高的拷贝数经氯霉素扩增后，每个细胞达1

14、0003000个拷贝。,一、质粒载体,r,r,pBR332质粒结构示意图,（二）pUC质粒载体系列,在pBR322基础上改建而成,一、质粒载体,典型的pUC质粒载体有4个组成部分：来自pBR322 质粒的复制起始点Ampr基因大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，称为LacZ基因位于LacZ基因中靠近5-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能,pUC系列的优越性,最通用的大肠杆菌克隆载体之一优点具有更小的分子量和更高的拷贝数构建pUC系列时仅保留了pBR322的复制子和Ampr具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ基因，适应于组织化学筛选重组体,一、

15、质粒载体,r,pUC18/pUC19质粒载体结构,病毒基本结构：DNA（或RNA）+外壳蛋白感染细菌的病毒，称为噬菌体。分类（根据病毒与宿主的关系）：温和性病毒：溶原性增殖构建病毒载体烈性病毒：溶菌性增殖改造后,二、噬菌体和病毒载体,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性：生物结构,l 噬菌体常指大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个bp,COS区:噬菌体两端存在的12bp的互补序列.,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,

16、复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,gt10（插入型）结构,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度

17、26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,Charon 40（替换型）结构,75%105%,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1-2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜

18、色反应类标记,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因灭,活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA

19、则产,生蓝色透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性：生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白

20、分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混,浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊,斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,噬菌体或病毒DNA,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链

21、DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,病毒载体：一、Ca MV克隆载体花椰菜花叶病毒组（CaMV）特点：唯一以双链DNA做为遗传物质的植物病毒，共12种病毒。在插入外源DNA厚会失去病毒感染性，不能直接感染植物。,二、烟草花叶病毒（TMV）克隆载体单链RNA，6395bp特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散常用作植物表达克隆载体,三、SV40克隆载体哺乳动物基因克隆载体（猿猴空泡病毒40）（一）SV40基因组双链闭环DNA：5243bp,（二）

22、SV40-DNA复制与增殖猿猴细胞受纳细胞嚙齿动物（小鼠、仓鼠）非受纳细胞；细胞癌变人：12%细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全,三、穿梭载体（shuttle vector）,带有原核和真核细胞的复制起始点常将真核生物的克隆载体构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩增，将目的基因与之构成合适的重组体后，再转入真核细胞若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因,三、穿梭载体（shuttle vector）,真核系统载体还必需具备适当的筛选标记一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。另一种普遍使用的是抗新霉素基

23、因。因此，真核克隆载体的构成一般由来自噬菌体、质粒和病毒的DNA元件构建而成。,三、穿梭载体（shuttle vector）,（二）逆转录病毒载体,（一）SV40（猿猴病毒）载体,（一）SV40（猿猴病毒）载体,真核表达载体中的调控元件大都来源于SV40的调控顺序和复制信号 用SV40作为载体有两种方式用SV40 DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。,三、穿梭载体（shuttle vector）,例：PSVK3质粒,PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。,三、穿

24、梭载体（shuttle vector）,PSVK3具有下列构件：原核系统构件：复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl;筛选标志（Ampr）；启动子（T7启动子）。真核系统构件：SV40复制起始点；SV40早期启动子RNA修饰信号：SV40小T抗原拼接信号；SV40早期区mRNA polyA加尾信号。多克隆位点：SV40启动子下游有8个酶切位点。,三、穿梭载体（shuttle vector）,pSVK3质粒,（二）逆转录病毒载体,逆转录病毒载体具有几个特点具有广泛的哺乳动物细胞宿主较大的容量，能插入7kb大小甚至更大的外源基因,三、穿梭载体（shuttle vector）,病毒基因组自身含有完整高效

25、的调控元件病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系,逆转录病毒载体的局限性：逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞；装载容量较小，仅8kb左右，不适用于较大的基因；安性问题，最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生型病毒,三、穿梭载体（shuttle vector）,常用外源DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为卸甲载体（disarmed vector）。,四、人工染色体(artificial chromosome),酵母人

26、工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC）哺乳动物人工染色体（MAC）,YAC主要调控元件,着丝粒 保证染色体细胞分裂过程中正确分配到 子代细胞端粒 防止染色体被核酸外切酶降解的功能复制起始点和限制性酶切位点,四、人工染色体,筛选标记 YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选原核序列及调控元件 包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作,YAC作为载体的主要特点,酵母是单细胞真核生物，培养方便；酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因；装载容量巨大，可达Mb

27、p水平；,四、人工染色体,YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆；DNA在片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，随后该重组体可通过常规方法导入酵母；已广泛应用于各种生物基因组计划。,质粒,质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cc

28、cDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒,质粒DNA的分离纯化,碱溶法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,质粒,质粒DNA的分离纯化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶

29、裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,考斯质粒与噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和,1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA,的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，,就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序,列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时,又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这,便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒,和噬菌粒

30、不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内,不能形成噬菌体颗粒。,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为31-45 kb,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外

31、包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（p

32、hagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3

33、,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,

34、人造染色体载体,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,o

35、ri,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350-400 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,C 用于基因转移的受体菌或细胞,3 基因工程的基本条件,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hs

36、dR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,各种基因工程受体的特性,大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定,适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,产结构复杂、种类繁多的内毒素,各种基因工程受体的特性,枯草杆菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素,适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌,遗传欠稳定，载体受体系统欠完

37、备,各种基因工程受体的特性,链霉菌,抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传不稳定，生长相对缓慢,各种基因工程受体的特性,酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,内源性蛋白产物种类繁多且含量高,各种基因工程受体的特性,昆虫细胞（家蚕）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定,适用于真核生物基因的高效表达,DNA重组

38、操作系统欠完善,各种基因工程受体的特性,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,细胞培养条件苛刻，生长缓慢,各种基因工程受体的特性,植物细胞（拟南芥菜、烟叶）,农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用,适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,遗传操作繁琐,实验室常用的基因工程受体,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654,酵母菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母,啤酒酵母,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,