重组体的筛选第四章.ppt

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1、,第四章 重组体的筛选（Rebinant Screening),第一节 重组 DNA导入受体细胞,一、外源DNA片段同载体分子的重组二、受体细胞三、重组 DNA导入受体细胞的方法四、转化(transformation),第二节 重组体的筛选,一、遗传表型筛选法（Genetic phenotype selection）二、电泳筛选法（Electrophoresis selection）三、分子杂交检测法（Molecular hybridization selection）四、免疫化学检测法（Immunochemical selection）五、亚克隆法（Subcloning selection）

2、,第一节 重组 DNA导入受体细胞,一、外源DNA片段同载体分子的重组1、外源DNA片段同载体分子的连接方法（1）平末端（2）粘性末端 衔接体（linker)结合体（adaptor)同聚体加尾（homopolymer）,二、受体细胞,1、受体细胞(receptor cell)的概念2、受体细胞的选择原则1）便于重组DNA的导入2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中3）便于重组体的筛选 选择与载体所含的选择性标记相匹配的受体细 胞基因型4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长,5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表

3、达产物在细胞内的积累。7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏好性编码氨基酸的同义密码子之间的选择是有偏好的。植物的叶绿体和线粒体基因在同义密码子第三位上偏好使用A、U8)具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达9)在理论研究和生产实践上有较高的应用价值,（一）原核生物细胞,1、理想的受体细胞类型1）没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入2）没有核膜，染色体 DNA没有固定结合的蛋白质3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析4）单细胞生物,缺欠：,1、不具备真核生物的蛋白质折叠系统2、缺乏真核生物的蛋白质加工系统3、内源性蛋白酶降解空间构象

4、不正确的异源 蛋白，造成表达产物不稳定。大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌,枯草杆菌,1)枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因2）不产生内毒素3）具有芽孢形成能力,（二）真菌细胞,1）简单的真核生物2）蛋白质翻译后的修饰加工系统3）不含特异的病毒，不产生毒素4）培养简单5）外源基因表达产物分泌至培养基中,（三）植物细胞,全能性（四）动物细胞1）识别除去外源真核基因中的内含子2）翻译后能能被正确的加工与修饰3）易被重组DNA质粒转染4）产物分泌到培养基中,三、重组 DNA导入受体细胞的方法,1)转化（transformation）2)转染（transfection）3)显微注射技术（microinjectio

5、n）4)电转化法（electro-tranformation）,也称为电穿孔（electroporation）5）基因枪法（gene gun/particle gun），又称微弹轰击（micro-projectile bombardment）6）脂质体介导法（liposome mediated gene transfer）7）花粉管通道法,质粒的不相容性(inpatibility)每个细菌细胞只能导入一个质粒DNA分子；每个菌落（一个单克隆）都是由一个细菌细胞形成的；每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒,2、受体细胞的感受态,（1）感受态细胞（petent cell)的概念（2）感受态的机制

6、 局部原生质体化假说 即局部失去了细胞壁结构或局部溶解细胞壁，使外源DNA分子能通过质膜进入细胞。酶受体假说 感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。,（3）转化的过程 冰冷的50m mol/lCacl2溶液DNA分子在转化过程中将经历四个阶段第一个是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面第二个为转入阶段，双链的DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子一起复制，并被转录转译。,（4）转化反应,转化反应是使重组体DNA分子在热

7、休克（heat shock）的短暂时间之内被导入受体细胞 1）取制备好的感受态细胞100l，置冰上5min融化。2）加入重组10l，冰上放置30分钟。3）将管置42恒温水浴中热休克90秒钟，再置冰上10分钟。4）向管中加入LB液体培养基1ml，混匀后置37恒温臬中保温1小时。,宿主细胞少数能发展感受态细胞万分之一的质粒分子能够进入感受态细胞极少数能够良好的增殖,（5）转化率(transformation efficiency),（5）转化率(transformation efficiency),转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示

8、，以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示,练习,1 ng l kb DNA的分子数约为 1 109个 如果用1 ng l kb DNA进行转化处理，得到1000个转化子，转化率是?答案：转化率是103109=10-6 含义是106个DNA分子才能获得1个转化子。,第二节 重组体的筛选（Rebinant Screening/Selection）,筛 选,选 择,1,2,选择（selection）与筛选（screening）,选择压力（抗药性的选择）,细胞群中进行鉴定（蓝白筛选）,为什么要进行重组体的筛选？,需要的重组DNA分子,连接体系,未连接上的载体分子,未连接上的DNA片段,连接污染

9、DNA片段的重组DNA分子,宿主细胞108（转化率10-6）,100个转化子 9 999 900个未转化的细胞,目的重组DNA分子连接污染DNA片段的重组DNA分子 插入失活法自身环化的载体分子,目的重组DNA分子 连接污染DNA片段的重组DNA分子,目的重组DNA分子连接污染DNA片段的重组DNA分子 自身环化的载体分子,插入失活法,凝胶电泳筛选方法分子杂交,Genetic phenotype selection,Sub-cloning selection,Immunochemical selection,Electrophoresis selection,遗传表型筛选法,Molecular

10、 hybridization selection,重组体的筛选方法The methods of rebinant selection,一、遗传表型筛选法（Genetic phenotype selection）,1、抗药性筛选/抗生素抗性筛选（Antibiotic resistance selection）2、插入失活法（Insertional inactivation）,一、遗传表型筛选法,1、抗药性筛选/抗生素抗性筛选（Antibiotic resistance selection）利用载体 DNA分子上的抗药性选择标记进行筛选 Apr(Ampr)：抗氨苄青霉素（ampicillin）基因

11、 Cmr(Cmpr)：抗氯霉素（chloramphenicol）基因 Kn r(Kanr)：抗卡那霉素（kanamycin）基因 Tcr(Tetr)：抗四环素（tetracymic）基因 Sm r(Strr)：抗链霉素（strentomycin）基因 Aps(Amps)：氨苄青霉素 敏感（sensitive）基因,正向选择方式：,含质粒（重组）的受体菌能在抗药性培养基生长 不含质粒的受体菌不能在抗药性培养基生长 注意：Tc、Cm、Ap：观察和确定转化子菌落的培养时间以1216小时为宜,pBR322质粒载体的物理图谱,如何区分转化子中的重组子 和非重组子,2、插入失活法（Insertional

12、inactivation）,（1）抗药性基因插入失活法 质粒的抗药性基因(抗生素抗性基因)内部插入外源DNA片段，造成重组质粒的抗药性失活。,问题：,具有Ampr Tets 表型的细胞所携带的pBR322，在其 基因内带有插入的外源基因。,具有Amps Tetr 表型的细胞所携带的pBR322，在其基因内带有插入的外源基因。,（2）蓝白筛选法（Blue-white screening）-半乳糖苷酶显色反应/乳糖筛选（Lac screening）-互补（-plementation）筛选法,-互补（-plementation）,大肠杆菌株系 质 粒 修饰的Lacz基因（少Lacz 基因）pUC8（

13、Lacz 基因）-半乳糖苷酶的-半乳糖苷酶的 C末端 N末端-肽链-半乳糖苷酶 X-gal（显色剂）IPTG（诱导物）深蓝色菌落,-互补（-plementation）,大肠杆菌株系 质 粒 修饰的Lacz基因（少Lacz 基因）pUC8(Lacz)插入外源基因-半乳糖苷酶的 C末端 pUC8重组质粒 不能编码N末端-肽链 不能合成-半乳糖苷酶 X-gal（显色剂）IPTG（诱导物）白色菌落,蓝白筛选,X-gal（显色剂）：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷（5-bromo 4 chloro 3 indolyl-D galacto-pyranoside）IPTG（诱导物）：异丙基-D-硫

14、代半乳糖苷,-半乳糖苷酶可以将X-gal分解成一种深蓝色的产物，这个反应很灵敏。当带有氨苄青霉素的培养基中加有 X-gal及IPTG时，那些能合成完整-半乳糖苷酶的未重组子就会因它能酶解X-gal而变成深蓝色，而重组子因lacz基因被破坏不能合成完整的-半乳糖苷酶而呈白色，此谓蓝白筛选。,Blue-white screening,A more sophisticated procedure for screening the presence of rebinant plasmids,which can be carried out on a single transformation pla

15、te,is called blue-white screening.This method also involves the insertional inactivation of a gene,as the name implies,uses the production of a blue pound as an indicator.,The gene in this case is Lacz,which encodes the enzyme-galactosidase,then expression of a Lacz gene may be induced using IPTG,an

16、d the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate X-gal to yield a blue product.,Insertional inactivation of Lacz in the production of a rebinant plasmid would yield a white product.,二、电泳法筛选,凝胶电泳分离DNA分子的基本原理Separation of DNA molecules by gel electrophoresis,凝胶电泳分离DNA分子的基本原理Separation of DNA

17、 molecules by gel electrophoresis,1,2,3,质粒抽提筛选法,二、电泳法筛选,1、质粒抽提筛选法,碱裂解法主要是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异，当细胞在NaOH和SDS（十六烷基磺酸钠）溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，加入中和液醋酸钾后，进行离心，蛋白质与染色体DNA随细胞碎片沉淀下来，使质粒DNA留在上清液中。,2、限制性酶解法,电泳,质粒抽提,酶切,电泳或测序,质粒抽提,PCR,3、PCR的方法,三、分子杂交筛选法,、原理 1968年Cavnegie Institute of Washington 的Roy Britten发明

18、的。具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。,三、分子杂交筛选法,、原理杂种核酸分子 当带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起时，其相应的同源区段发生退火所形成的双链结构。探针 杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段。,2、杂交步骤,转移杂交,经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上,将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记 或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交,尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM)、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEA

19、E）,3、核酸分子杂交检测法的分类,Southern印迹杂交（Southern blot）Northern印迹杂交（Northern blot）斑点和狭线印迹杂交（dot and slot blotting）菌落和噬菌斑杂交（colony and plaque blotting）,（1）Southern印迹杂交（Southern blot）,鉴别DNA的杂交1975年英国科学家E.M.Southern发明的，杂交受体是DNA片段，受体从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维薄膜（或尼龙膜）上，与探针进行杂交。,（2）Northern印迹杂交（Northern blot）,鉴别RNA的杂交杂交的受体是RNA片

20、段，探针可用RNA也可用DNA，也需将受体从凝胶转移到氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM)上，与探针片段进行杂交。,（3）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（dot and slot blotting hybridization）,在Southern blot杂交的基础上发展的类似的快速检测核酸分子的方法。其主要步骤 为：采用抽真空或多孔过滤进样器将核酸转移到杂交膜上，进行杂交。众多的核酸样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，有规律的排列成点阵或线阵，此法因此得名。主要用于检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因。,（4）菌落和噬菌斑杂交(colony an

21、d plaque blotting),1975年，MGrunstein和DHosness根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，提出了菌落原位杂交技术。1977年，WDBenton和RWDavis又建立了与此类似的筛选含有克隆DNA的噬菌斑的杂交技术。,为什么菌落和噬菌斑印迹法杂交有时也叫原位杂交？因为生长在培养基的菌落和噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位上发生溶菌、DNA变性和杂交作用。,四、免疫化学检测法,用途：如待测的重组克隆子既无任何可供选择的基 因表型特征，又无理想的核酸杂交探针时，可以考虑采用免疫学方法筛选重组子 过程：免疫学检测法的基本过程与前述菌落分子杂交法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。分类：抗体测定法（antibody test）和免疫沉淀测定法（immuno-precipitation test）,五、亚克隆法,概念：所谓亚克隆或次级克隆（subcloning）是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。步骤：一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上，再转化宿主细胞，通过对转化细胞的表型鉴定或其他方法来确定基因所在的位置。,