重组DNA技术及其进展.ppt

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1、生物技术产品（传统和现代）,泡菜 米酒 酱油 红茶 高粱酒 豆瓣酱 饴糖 啤酒 面包 味精 葡萄酒 豆腐乳 酱菜 醪糟 青霉素等抗生素 醋,人胰岛素及胰岛素类似物 亚单位疫苗 DNA疫苗 转基因动物 转基因植物 克隆动物 转基因克隆动物,生物技术,国际合作及发展组织的定义 应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物和植物体作为反应器，将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。它包括传统和现代生物技术。,传统生物技术,包括造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食品的传统工艺。我国：石器时代后期,祖先利用谷物造酒；公元10世纪，我国就有了预防天花的活疫苗；西方：巴比伦人在公元前6000年开始啤

2、酒发酵，埃及人在公元前4000年开始制作面包；50年代，在青霉素大规模发酵生产的带动下，发酵工业和酶制剂工业大量涌现；发酵技术和酶技术被广泛应用于医药、食品、化工、制革和农产品加工等领域。,现代生物技术,包括细胞工程、酶工程、发酵工程等，将会为解决人类面临的重大问题（如粮食、健康、环境、能源等）开辟广阔的前景，它与计算机微电子技术、新材料、新能源、航天技术等被列为高科技，被认为是 21世纪科学技术的核心 现代生物技术是如何诞生的？生物技术是如何实现从“传统”向“现代”的飞跃的？它的核心技术是什么？,重组DNA技术及其进展,重庆医科大学医学检验系 周 兰,硕士生学位课程：基因组学之,个人简介,1

3、984年 医学学士1989年 医学硕士1997年 医学博士00-03 芝加哥大学访问学者2003年 教授2004年 博士生导师研究方向 分子肿瘤学和肿瘤分子诊断联系方式,本讲纲要,1 重组DNA技术概述 2 重组DNA技术的基本步骤 3 重组DNA技术的进展 4 重组DNA技术的应用,1 重组DNA技术概述RecombinantDNATechnique,1-1 定义 体外、有目的地人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个新的杂合DNA分子，然后将之导入宿主细胞去复制扩增或表达,重组DNA分子（重组子）,不同来源的DNA分子以共价键连接，形成的杂合DNA分子即重组DNA分子（recombina

4、nt DNA molecule)。通常是指外源DNA分子（目的基因）与载体分子结合所形成的杂合分子。,It is a form of DNA that does not exist naturally;It has been created artificially on purpose.,该技术的意义 通过重组DNA技术，可有目的地：改变生物的遗传特性 创造生物的新性状,瑞士金大米,富含胡萝卜素,1-2 重组DNA技术的开拓者,1)The Recombinant DNA technique was first proposed by Peter Lobban,a graduate stude

5、nt at the Stanford University(Department of Biochemistry).2)19721973年，科学助产士Berg和Cohen等将该技术接到了人间。,斯坦福大学生物化学系：Berg(1972）用EcoRI切割SV40DNA和phage DNA，再连接成重组DNA分子。但是，他没继续证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。Paul Berg is awarded the Nobel Prize in chemistry in 1980 for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic

6、acids,with particular regard to recombinant-DNA.,实现第一次DNA重组的科学家,P.伯格(1926)美国生物化学家,斯坦福大学 Cohen加州大学旧金山分校Boyer1973年宣布：体外构建的重组质粒能够在细胞中表达。完善了Berg开创的重组DNA技术。1973年-基因工程元年。,*将pSC101（具有四环素抗性）与pSC102（具有卡那霉素抗性）连接后转化大肠杆菌，后者获得了这2种遗传性状；*将编码蟾蜍rRNA的基因与pSC101连接后转化大肠杆菌，后者能够产生蟾蜍的RNA，表明真核基因能够在原核细胞中表达。,构建第一个有功能重组子的科学家,S

7、tanford University,位于旧金山市，创建于1885年的私立大学；占地8180英亩，校园具有一种粗犷、开阔之美，大片的树林和山地，红瓦黄墙、古朴的砂岩建筑、优雅的胡佛塔，典雅庄严、饰满壁画的纪念教堂，罗丹深沉的雕塑群，处处显示出名牌学府的厚重、深邃的学术氛围。1920年斯坦福大学还只是一所“乡村大学”，到了1960年便名列前茅，到1985年更被评为全美大学的第一名。它是硅谷的孵化器；同时，硅谷的发展也促成了它今天的成就。创办人美国实业家利兰斯坦福(Leland Stanford)在开学典礼上强调：“生活归根到底是指向实用的，你们到此应该是为了给自己谋求一个有用的职业。但也应明白，

8、这必须包含着创新、进取的愿望，良好的设计和最终使之实现的努力。”,2 重组DNA技术的基本步骤,分/合成：制备目的基因切:RE酶切目的基因和载体接：连接酶连接2个DNA分子转：重组子转移到受体细胞筛：从大量细胞克隆中，筛选出含重组子的受体细胞克隆（即阳性菌落）鉴：从阳性菌落中提取目的基因，进一步鉴定其序列正确性（例如，PCR时是否有错配）,2 重组DNA技术的基本步骤,2-1 目的基因（I）的获得2-2 目的基因和载体的酶切 1）限制性内切酶 2）载体 3）酶切时酶的选择2-3 目的基因与载体的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定,Insert,外源基因,2.1 目的基因/目的D

9、NA/Insert的获得,目的基因：拟导入受体细胞进行扩增或表达的外源基因片段获取方法：根据对目的基因序列的认识程度，采用不同的策略,2.1 目的基因的获得,1）化学合成法：序列已知的基因可用该法获得 DNA全自动合成仪准确性高，合成速度快；造价也高。所以很少用来合成大片段基因。2）聚合酶链式反应（PCR)部分或全部序列已知的基因，可通过PCR技术高效扩增；是实际工作中常用的方法。不足：可能会因为错配导致目的基因序列的改变（第35轮复制后的错误几率达0.25%）；对策：高保真酶；低循环数等。所以，重组过程完成后，要经过测序验证。,2.1 目的基因的获得,3）从基因组DNA中直接分离 适用于基因

10、组较小、遗传背景清楚的细菌、质粒和病毒DNA的分离。用RE或机械方法将提取的染色体DNA断裂，通过电泳分离所获DNA片段，再用标记的探针从中“钓取”目的基因。,回收阳性片段,2.1 目的基因的获得,4）从各种基因文库中筛选目的基因：（1）基因组文库（genomic DNA library）：从理论上讲，其包含一种生物基因组DNA的全部序列。（2）cDNA文库（cDNA library)：含一种生物的全部表达基因。（3）筛选方法：核酸杂交或PCR等,*探针和引物设计依据：该基因的部分序列、蛋白产物的氨基酸序列、与该基因紧密连锁的一些分子标记等,2 重组DNA技术的基本步骤,2-1 目的基因的获得

11、2-2 目的基因和载体的酶切 1）限制性内切酶（基因刀）2）载体 3）酶切时酶的选择2-3 目的基因与载体的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定,什么是载体？为什么要酶切？怎样酶切？,1）基因刀-限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE),（1）定义：由细菌产生、能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在该处水解磷酸二酯键、切断DNA双链的核苷酸内切酶 简称限制酶或内切酶 是重组DNA技术中的重要工具酶（2）分类,（3）型限制酶的识别及切割,它识别的是回文序列，即两条结构相同、方向相反的序列，也称为反向重复序列。例如：GTT AAC GGCC C

12、AA TTG CCGG,回文：是正读反读都能读通的句子，是一种修辞方式和文字游戏。例如：人人为我，我为人人；人过大佛寺，寺佛大过人 Fall leaves as soon as leaves fall.回文年：1991；2002；2112,（3）型限制酶的识别及切割,酶的特性*识别的靶序列与DNA的来源无关*特异识别/切割的回文序列多为48bp*酶切产物：5-P，3-OH*切割方式：平切 和 错位切,（3）型限制酶的识别及切割,平切产生平(末)端/钝端（blunt end)两条链上的断裂位置是回文序列的对称轴，即平切，这种形式的断裂产生平末端或钝端,（3）型限制酶的识别及切割,错位切产生粘性末

13、端：RE在两条链的不同部位特异的错开几个核苷酸切割；其产生的单链末端，即为粘性末端，包括5-粘端和3-粘端,“粘性”是指它与任何来源的、具有匹配序列的单链末端可以按碱基配对原则结合为双链的性能,（3）型限制酶的识别及切割,（4）RE的命名原则,第1个字母：表示其来源微生物的属名的第1个字母，斜体，大写。第2、3字母：表示其来源微生物种名的前2个字母，斜体，小写。其它字母：表示其来源微生物菌株号，正体，大或小写。罗马数字：表示从该菌株发现的限制酶的编号。-1973年,常用RE的信息,至今，人们已经在上万种微生物中筛选限制酶，已经发现了3000多种，它们大约有230种不同的识别位点。如果需要查阅特

14、定酶的相关信息，可访问 http:/,2 重组DNA的基本步骤,2-1 目的基因的获得2-2 目的基因和载体的酶切 1）限制性内切酶 2）载体（=运载工具）3）酶切时酶的选择2-3 目的基因与载体的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定,2)目的基因的转运工具-载体,载体（vector）：是在相应细胞中能够自主复制的、由DNA分子构成的遗传成分，又叫复制子。功能：携带外源DNA（目的基因）进入指定的受体细胞，并能够在其中复制扩增或转录或表达。,（2）载体必须具备的基本特性,能独立复制，拷贝数高（10-200个/cell)有MCS,以便外源基因的插入有选择性遗传标记（抗药基因等），以

15、便筛选有足够的容量，以容纳外源DNA片段与受体细胞有亲缘性，易于进出使用安全（对使用者和环境）,*表达型载体还应具备与受体细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；*多克隆位点（MSC，multiple cloning site）：是一段含有多种限制酶的单一切点的DNA序列，它有利于外源基因插入该区。,（3）载体分类-按功能分,克隆载体：其产物是目的基因的大量拷贝；转录载体：其产物是目的基因转录的RNA；表达载体：其产物是目的基因编码的蛋白质，其除具克隆载体的基本元件（ori,Ampr,MCS等），还要具有转录/翻译所必需的DNA调控序列。,（3）载体的分类-按受体细胞类型分,原核载体:

16、以原核细胞为受体细胞的载体真核载体：以真核细胞为受体细胞的载体穿梭载体（shuttle vector）：含原核和真核生物的复制子、能够在原核和真核细胞中存在和复制的载体，因而可以运载目的基因穿梭往返于两种生物之间。,真核基因通常是先在原核细胞中扩增，再在真核细胞中表达。,（3）载体的分类-按载体自身特性分,质粒（plasmid)噬菌体(bacteriophage)粘性质粒/粘粒(cosmid）M13噬菌体（phage M13）酵母人工染色体（YAC）病毒载体（virus vector）,原核细胞载体,真核细胞载体,（4）常用的载体举例,质粒：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的小分子、双链、环

17、状DNA。最广泛应用的质粒 如pBR322、pUC系列等。,pBR322质粒结构,4.36kb；50-100拷贝/cell 一个复制起始点（ori)一个抗氨苄青霉素标记(ampR)一个抗四环素标记(tetR)ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入；当外源基因插入抗药基因位点时，AmpRAmpS、TetRTetS.用于目的基因克隆受体细胞包括JM107,JM109,HB101,LE392等,pBR322质粒的优点,分子量小、克隆容量大、转化率高、易纯化等；（经验表明，为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂，克隆载体最好不要超过10Kb）；抗菌素抗性基因2个，可作为选择标记

18、；pBR322质粒载体还具较高的拷贝数，且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000-3000个拷贝，这为重组DNA分子的高效制备提供了极大的方便。*氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制出更多的拷贝。,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的质粒载体；(1)2.67kp；2千-3千拷贝/cell（2）AmpR（3）MCS（4）引入LacZ操纵子的DNA片段作为选择标志，可应用蓝白色菌落筛选（5）用于基因克隆和测序（6）其受体细胞包括JM101,JM105,JM107,JM109,MCS,其它载体,*phage：可插入5kb到23kb的外源DNA。*粘粒(cosmid

19、）：克隆极限达45kb，多用于克隆大片段和构建基因组文库。*M13单链噬菌体载体：可插入300400bp；可从细菌培养液中大量抽取单链DNA，可用来作为DNA测序的模板；也可用来产生单链的DNA探针。*穿梭质粒载体：如大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体；*体外转录的质粒载体：pGEM-3Z/4Z，用于制备RNA探针等；*更大片段DNA的克隆载体：细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC，约300kb容量）；酵母人工染色体（yeast AC，YAC，容量为0.2-2Mb）,2 重组DNA技术的基本步骤,2-1 目的基因的获得2-2 目的基因和载体的酶切

20、1）限制性内切酶 2）载体 3）酶切时酶的选择2-3 目的基因与载体的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定,3）目的基因和载体的酶切,选择RE时要考虑的关键因素：*切后的V与I之间的连接效率*重组后，阅读框不能改变*连接形成的“接点”序列，应能被一定的限制酶重新切割，以便随后的鉴定和扩增后外源基因片段的回收。,*多酶联合应用时,对盐浓度要求相同的酶，可以同时酶切；对盐浓度要求不同的酶，则可以：选用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶切；低盐酶先切，然后加大盐浓度，高盐酶再切；一种酶先切，更换缓冲液，另外的酶再切,1U的内切酶活性：在最佳反应条件下反应1个小时，完全水解1g的

21、标准DNA所需的酶量。,2 重组DNA技术的基本步骤,2-1 目的基因的获得2-2 目的基因和载体的酶切 1）限制性内切酶 2）载体 3）酶切时酶的选择2-3 目的基因与载体的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定,2.3 目的DNA与载体DNA的连接,接,DNA ligase,“基因缝针”“glue”,在体外、由DNA连接酶催化是重组技术的核心步骤；连接酶是重组技术的重要工具酶。,2.3 I与V的连接,连接的实质：双链DNA的 5-P与相邻的3-OH之间形成新的共价键，即 3，5-磷酸二酯键。,35磷酸二酯键,#连接的方式,(1)匹配的粘端连接 全同源粘端的连接、定向克隆 不匹配

22、粘端的连接 平端连接 用T4 DNA连接酶直接连接 同聚物加尾法 连接子（linker)、双连接子 普适子（adaptor，套头，适应子，衔接体),（1）匹配粘端的连接 全同源粘端的连接,特点：多是单酶切的结果；全同源，连接效率高；重组分子上保留了原限制酶的切点，有利于随后的酶切鉴定和扩增后目的基因的回收。,EcoRI,该类连接的不足之一：自身环化。两末端序列是互补的，可自连（尤其载体分子），影响I插入V。,载体自身环化：已线性化的载体重新自身封闭成完整质粒,防自身环化的对策A 碱性磷酸酶使载体去磷酸化 带5-P的外源DNA分子可有效地与去磷酸化的的载体分子连接，产生带2个缺口的开环重组分子；

23、后者在转入宿主细胞后的扩增过程中，这2个缺口自动修复。B 定向克隆（见后）,不足之二：多拷贝插入，增加筛选难度；对 策：调整两者的分子数比,不足之三：双向插入，增加筛选难度 对 策：定向克隆,使目的基因按既定方向插入载体的重组方案。方法和原理：双酶切，使V、I酶切后自身的两粘端不匹配或“一平一粘”；如此，连接时它们只能按唯一的连接方向重组成新的DNA分子 优点：*避免自身环化，提高重组效率；*实现定向插入，减少后续的工作量。,定向克隆,（2）不匹配粘端的连接,当I与V之间无理想的RE酶切位点时，只能用不同的RE；其酶切产物的末端序列不匹配，不能直接连接。对策：变成平端 方法：5-粘端-补齐或削

24、平3-粘端-削平,不匹配粘端变平端,再连接,补齐,削平,(3)平端连接,平端的来源 平切的限制酶 机械断裂的DNA 逆转录生成cDNA 不匹配粘端补齐或削平后,平端连接具有普适性，即可用于任何DNA片段间的连接，是非常有用的克隆策略。,(3)平端连接,平端连接的基本方法：用T4DNA连接酶直接连接,特点：粘端DNA分子相遇时，匹配碱基之间可先形成一种暂时的结合；而平端相互间无匹配碱基；因此，即使相遇，也会很快分开。从分子动力学角度看：2匹配粘端之间的连接属分子内连接；2个平端之间的连接属于分子间的连接，因此，连接速度慢。,不 足：连接效率低、双向插入等一般性对策：*高浓度的DNA和连接酶*在体

25、系中加入低浓度PEG特别对策？有！,平端连接的改进方法,A、同聚物加尾法：其实质是变为匹配粘端，再连接。即用末端转移酶催化dNTP添加到DNA分子的3-端，人工形成互补/匹配的多聚核苷酸粘性末端。,polyG尾,载体的3-端-多聚G(polyG)目的基因的3-端-polyC退火时即互补结合，从而实现载体与目的基因之间的连接。polyA与polyT呢？一样可用！,平端连接的改进方法,B、连接子法 连接子（linker)：是人工合成的、1012bp的双链寡核苷酸片段，平端，且含RE切点。使用时，将之引入目的基因的两端，再酶切产生粘端，然后与载体连接。,连接子及其酶切和连接,想想：该法有什么不足？如

26、何解决？,平端连接的改进方法,双连接子：在目的基因两端引入带不同酶切点的连接子，双酶切后再连接，此即定向克隆 防自身环化 防双向插入 利于克隆片段的鉴定 利于克隆片段的回收,平端连接的改进方法,C、adaptor（普适子，套头，适应子)人工合成的、至少一端为粘端的短双链DNA，其中包含RE酶切后产生的粘端；其与载体连接的是粘端；与目的基因连接端则“可平可粘”美国康奈尔大学生化分子生物学系吴瑞博士于1978年发明。,连接子与普适子比较,3）连接方式小结,(1)匹配的粘端连接 全同源粘端的连接-多是单酶切后的连接 定向克隆-双酶切(2)不匹配的粘端-变成平端，再连接（3）平端连接 直接连接 同聚物

27、加尾法 连接子（linker)、双连接子（定向克隆）普适子（adaptor，套头，适应子),*同聚物加尾法连接的产物及部分T4连接酶直接连接平端的产物无法用原来的RE来实现特异性的切割和回收（插入片段）Why?,4）连接的条件,（1）温度和时间：12-16，连接12-l6h（overnight）（2）连接酶的浓度：平端连接用1-2U，粘端连接用0.1U，即可达到最佳效率。实际应用时参照说明书（厂家不同，活性相差大）。（3）插入片段与载体分子的摩尔比值为2-3：1,*1U的连接酶：在最佳反应条件下，15反应1小时，完全连接1g-DNA（Hin DIII片段）所需要的酶量。,2 重组DNA的基本步

28、骤,2-1 目的基因的获得2-2 目的基因和载体的酶切 1）限制性内切酶 2）载体 3）酶切时酶的选择2-3 目的基因与载体的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定,2.4 rDNA导入受体细胞,1）导入的目的 扩增外源基因 获得其表达产物 rDNA导入宿主细胞，利用其生理条件，重组载体（如质粒）得以扩增，获得足够量的rDNA拷贝-1分子rDNA,1分子外源基因,2）受体细胞种类及基本特性,（1）原核细胞：既可复制扩增、又可表达外源基因；最经典和最常用的受体细胞是大肠杆菌。（2）真核细胞：用于基因表达，如哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞。（3）基本特性 易接纳rDNA 对载体复制扩增无

29、严格限制 不降解/不修饰外源DNA分子 符合安全标准,3）外源基因导入的相关概念,转化(transformation)：rDNA导入原核细胞（细菌等）的过程。感受态细胞(Competent Cell)：经特殊处理后易接受外源DNA的受体细胞-细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，以利于DNA分子的吸附和吸收。,转染(transfection):将rDNA导入真核细胞的过程。感染(infection)：通过携带rDNA的病毒感染受体细胞，从而把外源DNA转移到受体细胞的过程。,4）导入原核细胞的常用方法,（1）氯化钙转化法：最经典、应用最广泛。原理：在0、2价阳离子的低渗溶液中，细菌膨胀成

30、球形（感受态）；在42 的热冲击下重组子可进入细胞；在培养基上生长数小时，球形细胞恢复原状并繁殖。转化率：105-6转化子/gDNA（转化子：经过转化获得外源遗传物质的细胞）,42,氯化钙法,（2）电穿孔法(electroperation)-电穿孔仪,原理：随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄；当膜电压升到一定数值时，膜被击穿，形成微孔，外源基因由此进入细胞质内；切断电场后，被击穿的膜孔可自行复原 优点：转化率高，108-9转化子/g DNA；原核和真核细胞均可。不足：如电压过大，致不可逆的膜 损伤，细胞成活率低 大致参数：电压：300600V；冰上操作 维持时间：20100ms,电穿孔法原

31、理及流程示意图,2 重组DNA技术的基本步骤,2-1 目的基因的获得2-2 I和V的酶切 1）限制酶 2）载体 3）酶的选择2-3 I与V的连接2-4 重组子的转化2-5 重组子的筛选和鉴定（Why?How?),转入1-3的受体细胞是否都可在含抗生素的培养皿中生长？为什么？如何分辨“内涵不同”的菌落？,2.5 重组DNA分子的筛选与鉴定,1）为什么要筛选和鉴定（1）重组率不可能达到100%（2）凡是转入了载体的细胞都获得了相应的抗生素抗性，都可以在平板上生长菌落，其中包括了转入空载体或反向插入或多拷贝插入等的细胞。（3）PCR扩增的插入片段，还需要鉴定序列的正确性。因此，重组体的筛选和鉴定乃重

32、组DNA技术的重要步骤。,筛/鉴,（1）插入失活筛选（2）蓝/白色筛选（3）限制酶切图谱筛选（4）原位杂交技术（5）免疫学方法（6）PCR筛选重组体（7）核苷酸序列测定,2）筛选和鉴定方法,3）抗生素抗性基因插入失活法,最早、最广泛使用的方法。例如：pBR322质粒具有Ampr和Tetr 原理：插入失活（或插入缺失）在体外重组中，I插入V的Tetr基因序列中,致其失活；该重组子转化的宿主细胞便不能在含Tet的平板上生存。,操作程序：先将转化液涂布含有Amp的平板；再将Amp平板上的转化子（菌落）影印至同时含有Amp和Tet的平板上；结果判断：在Amp平板上生长、但在Amp和Tet平板上不长的转

33、化子即为含重组子的菌落。,4）-互补筛选（蓝白色菌落筛选）,原理：载体中的LacZ(N)是E.coli DNA的短区段，编码半糖苷酶N端的 146个AA（也称多肽），其中的Plac可以启动LacZ的转录和表达，但受抑制；IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）能够去抑制；受体菌JM103含LacZ(C)，可编码半乳糖苷酶的C端部分互补：当该类载体转入相应受体中，LacZ(N)与LacZ(C)编码的产物可以组合成具有活性的酶蛋白，使底物X-gal分解生色（5溴4氯3吲哚半乳糖苷），因此出现蓝色菌落。当在MCS内的LacZ（N)序列中插入外源基因后，该基因便不能正常表达，因此也就不能与受体菌实现互补作用，所

34、以菌落呈白色。,4）蓝白色筛选-原理示意图,3）限制性酶切图谱法:基本流程-（1）挑选平板上的菌落小量培养快速提取质粒；（2）酶切（rDNA和载体）；（3）分析并比较凝胶电泳结果:依据插入片段的有无或/和重组子的大小即可判断所选菌落是否含重组子。,（4）核酸杂交法,原理：利用标记（如32P）的DNA或RNA探针，与转化细胞的DNA进行核酸杂交，利用同源DNA配对的原理筛选含有目的基因的重组子。关键：探针制备，其长度1001000bp。标记物：放射性同位素、生物素等 方法：菌落原位杂交和S-blot,步骤（以同位素标记为例）：将生长在平板上的菌落转移到硝酸纤维滤膜用碱（NaOH）处理膜上菌落，D

35、NA变性并释放到纤维素膜上80烘干膜（45h），使DNA牢固吸附在膜上将该膜与32P标记的探针反应（过夜），探针序列与目的基因互补杂交用一定离子强度的溶液冲洗该膜，以除去非特异吸附于膜上的放射性探针再烘干，放射自显影按底片上阳性点的位置找出其在培养基上相应的菌落，此即含重组子的菌落。,（4）核酸杂交法,菌落原位杂交技术,5）PCR筛选 以重组DNA为模板，PCR法直接扩增外源基因，电泳鉴定/序列分析：是否有目的基因存在。6）免疫反应筛选：此法不是直接检测（目的）基因，而是检测该基因编码的产物（利用抗原抗体反应），以此来筛选含有目的基因的转化细胞。7）核苷酸序列测定 经上述方法筛选的重组子，还需

36、要通过测DNA序列测定，此乃最后鉴定：*如是已知基因：确认本次重组是否准确无误，尤其插入片段来自PCR时；*如是未知基因：明确其结构，以推测其功能。,3 重组DNA技术的进展,3-1 提高连接效率3-2 TA克隆3-3 TOPO系列连接方法其它（略）,3-1 提高连接效率,NEB公司生产的快速连接试剂盒 T4 DNA连接酶高达2000U/ul，是其它产品的400倍，因此连接效率大为提高：overnight vs 5 min（sticky or blunt ends）,3-2 T-A克隆,直接重组PCR产物的简便方法。原理：TaqDNA聚合酶在扩增目的基因的同时，可以不依赖模板而在产物的两端加上

37、游离的A；因此，只要在载体切口处加上游离的T，PCR产物就可在T4 DNA连接酶催化下直接与载体连接！该法已广泛应用；商品化的载体如pGEM-T,Taq 酶同时具有末端连接酶活性，会在每条产物的3-端自动加上非模板依赖碱基,而且对A优先,所以，PCR产物末端的多余碱基大部分都是A,3-3 TOPO系列连接方法-无需连接酶,*TOPO Cloning is a molecular biology technique in which DNA fragments amplified by either Taq or Pfu polymerases are cloned into specific

38、vectors without the requirement for DNA ligases.*The key to TOPO cloning is DNA topoisomerase I,which functions both as a RE and as a ligase.*Vaccinia virus（牛痘病毒）topoisomerase I specifically recognises DNA sequence-5-(C/T)CCTT-3.,1）TOPO TA克隆方法,原理：与TA重组一样，唯一不同是两者将PCR片段连接到T载体上的酶，该法用的是DNA拓扑异构酶I。TOPO TA

39、克隆试剂盒中包括（整个反应只需五分钟！）（1）Topoisomerase I载体：线性化，牛痘病毒的拓扑异构酶I连接在3-T的P上。（2）感受态细胞（3）SOC培养基等。该酶识别序列：5-(C/T)CCTT-3,Taq酶扩增产物的TOPO TA克隆示意图,该酶识别序列：5-(C/T)CCTT-3,2）TOPO平端克隆方法,Pfu DNA聚合酶等扩增的PCR产物呈平端。TOPO平端克隆法：改良载体-把ccdB（Control of cell death）基因并入到MCS中。结果-（1）当无I插入（自身环化）时，则ccdB基因表达，其蛋白破坏细菌的DNA促旋酶，致染色体降解、细菌死亡；（2）如有I

40、插入，则ccdB基因不表达，受体细胞可生长。可大大减少非特异性菌落，提高筛选效率。该法其余步骤同TOPO TA法，简单快速。,TOPO平端克隆方法原理示意图,但是，依然存在平端连接的共同不足：双向插入。重组子中，正、反方向的连接约各占一半。,3）定向克隆法（D-TOPO）,让载体的一端为GTGG，同时让正向引物的5端添加CACC与载体互补（一粘一平），这样就可定向插入PCR产物，重组效率在90%以上。,4 重组DNA技术的应用,20世纪以来，发展最快的学科之一对生命科学的许多领域产生了革命性的影响受重组DNA技术影响最大的是生物技术&现代生物技术是随着重组DNA技术的问世而“诞生”，即实现了生

41、物技术从“传统”向“现代”的飞跃。&它是现代生物技术的核心技术,比尔.盖茨预言，超过他的下一个首富必定出自基因领域；李远哲先生（诺贝尔化学奖得主）在北大百年校庆时说：亚洲国家如果在下次经济腾飞中有所作为的话，生命科学技术将是可能取得 比较大的突破的一个领域。,4 重组DNA技术的应用,4-1 在基础医学研究中的应用（1）获得靶基因的大量拷贝或/和表达产物供研究用（2）疾病相关基因的寻找和研究（3）构建各种DNA文库（4）制备转基因动物，构建人类疾病动物模型，为研究人类疾病、探索新治疗方法提供了有力手段,转基因动物（transgenic animals）就是指在其基因组内稳定地整合外源基因、并能

42、遗传给后代的动物。,4 重组DNA技术的应用,4-2 在疾病治疗中的应用1）生产重组蛋白质/多肽类药物（基因工程药物）*它们在组织细胞内含量甚微，常规方法提取很难满足临床应用；*利用重组技术和生物反应器（大肠杆菌、酵母菌、转基因动物和植物）可以大量生产，成本低，药效好，并且毒副作用小，已经在临床广泛应用。,生物反应器（bioreactor)：容许外源目的基因在其中表达的原核/真核细胞和转基因动/植物。它经历了三个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动/植物生物反应器。,基因工程生产胰岛素的原理示意图,（1）10克胰岛素=1000磅牛胰=200升发酵液（2）生长激素释放抑制因子 5mg=

43、50万只绵羊脑=9L发酵液（3）干扰素 1200 升人血=1升发酵液 治疗费用：血来源需2-3万美元/病人重组来源需200-300美元/病人,质粒类型？,胰岛素制剂,目前我国临床应用的胰岛素制剂种类：1）从动物（牛猪）胰腺组织提取纯化的胰岛素制剂：10克胰岛素=1000磅胰腺组织（量少，制备费力）2）人胰岛素及胰岛素类似物：有优势，逐占主流。人胰岛素如何制备：从人胰腺组织中提取或人工合成人胰岛素？（1966年12月24日，“人民日报”头版头条报道我国在世界上第一次人工合成结晶胰岛素。许多人认为，这一次中国人与诺贝尔奖距离最近，简直可以用“擦肩而过”来形容）,糖尿病发病情况：1)全球：2025年

44、全世界糖尿病患者将达到3亿人（WHO)；2)中国：目前糖尿病发病率为5%，但是病人数仅次于印度，居世界第二；3)重庆：糖尿病发病率6.62%（男8.89%,女3.72%,2009-09),1982年，首个投放市场的重组人胰岛素来自美国礼来公司；我国临床上一直使用动物胰岛素，而纯度更高、治疗效果更好的人胰岛素则完全依赖于从美国等发达国家进口（美国和丹麦等）；1998年，由甘忠如博士研制的中国第一个重组人胰岛素-甘舒霖终于问世；两年后，“甘舒霖”以其符合美国、欧盟药典标准和无可置疑的质量，赢得了国内外用户的认可。2001年，甘忠如博士研发小组成功研制出中国第一只超速效胰岛素类似物赖脯胰岛素“速秀霖

45、”；2002年，又成功研制出中国第一只长效胰岛素类似物甘精胰岛素“长秀霖”。,胰岛素类似物：是迄今为止最新、最先进的第三代胰岛素，与第一代动物胰岛素、第二代人胰岛素最大的区别就是：它能完全模拟人体生理胰岛素分泌模式，可以使血糖安全达标而不会出现低血糖，大大降低了糖尿病所引起的各种并发症的发生和发展。如果说动物胰岛素的出现旨在挽救糖尿病患者的生命，人胰岛素使糖尿病患者在一定程度上缓解糖尿病症状，那么，胰岛素类似物则可以控制糖尿病，即完全使糖尿病患者安全达标，能够和正常人一样控制血糖。,产品名称 治疗功能与医药范围 1.人胰岛素 治疗糖尿病 2.人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3.干扰素 治

46、疗癌症、病毒感染 4.干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5.干扰素 治疗癌症、病毒感染 6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7.红细胞生成素(EPO)治疗肾病性贫血，增加RBC及Hb 8.超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9.凝血因子 治疗A型血友病 10.乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11.神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12.脑啡肽 镇痛 13.降钙素 治疗骨质疏松症,已经生产的蛋白质和多肽类活性物质,目前重组药物研发重点,*从蛋白类药物转移到寻找更小分子的多肽药物 因为蛋白质的分子一般都比较大，不容易穿过细胞膜、血管壁等，因而影

47、响其药理作用的发挥，而小分子药物在这方面具有明显的优越性。*生物反应器研究重点从原/真核细胞转向转基因动/植物，如乳腺反应器。因为前者生产的产品需要复杂的纯化工艺，成本高；而转基因农产品和乳制品则可直接作为商品使用，简便，成本低。目前国内外已有上百种药用蛋白或多肽在植物中表达（干扰素、促红细胞生长素、抗原蛋白等）。,利用转基因动物生产重组药物,转基因绵羊生产抗胰蛋白酶，35g/1L羊奶=6000$1头羊=1个制药厂转基因山羊生产长效tPA转基因鼠生产人生长激素转基因绵羊奶-抗凝血酶7g/L 转基因奶牛-人促红素(EPO)；转基因羊生产血清白蛋白 药物存于奶中，省略提取纯化成本，并且饮用更方便！

48、,4-2 在疾病治疗中的应用,2）生产基因工程抗体药物 Genetic engineering antibody 根据研究者的意图，采用基因重组方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞表达-新型抗体（符合人的意愿）主要包括嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双价抗体和双特异性抗体。,人一鼠嵌合抗体：将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用。构建嵌合抗体的大致过程：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细

49、胞、CHO细胞)中表达。,人源化抗体（改型抗体）：进一步降低抗体的鼠源成分。抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变。人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。,FDA批准的26中抗体药物中，利妥昔Rituxan、英夫利昔Remicade、赫赛汀Herceptin和阿瓦斯汀Avastin都超过40亿美元，在治疗淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤及自身免疫病中显示了良好的临床疗效。例如：其中的针对血管表皮生长因子（VEGF）的抗体阿瓦斯汀（Avastin），可延长晚期结肠癌患者的生存期平均5个月，美国食品药品监督管理局（FDA）认为它几乎对所有的晚期结肠癌患者都有帮助，因此被批准为治疗晚期结肠

50、癌的一线用药。,抗体是对其抗原有极强专一性的魔弹或巡弋飞弹,医 疗以毒素连接抗体攻击病变細胞研 究以免疫转印法检测 特定抗原检 验以 ELISA 侦测特定 病原体,在美国药品市场上其占全部生物技术药物的 2000年 1/5(15/76）；2007年 1/3；全球年销售额：1997年 3.1亿美元；2003年 超过52亿美元；2007年 258亿美元；美国在全球抗体药物市场一支独秀，占90%：在FDA批准的26种抗体药物中，利妥昔Rituxan、英夫利昔Remicade、赫赛汀Herceptin和阿瓦斯汀Avastin都超过40亿美元，在治疗淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤及自身免疫病中显示了良