酶组织化学应用.ppt
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1、酶组织化学-水解酶及氧化还原酶 组织化学原理及方法,组织化学,狭义 应用化学和物理学原理在组织切片上,加入某种试剂使其与组织切片中欲检测的物质发生反应,最终形成有色沉淀,在显微镜下观察,以研究组织细胞结构与功能之间的关系。,1.基本原理,细胞内的酶催化分解合适的底物,生成中间产物(即初级反应产物)然后其中之一再与辅助物(或捕捉剂)反应,生成有色不溶性的终反应产物 该反应产物沉积在原位,以显示酶的存在,显示酶的组织化学方法1.金属沉淀法:磷酸酶的显示 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅2.偶氮偶联法:显示各种酶类最重要的方法,酸性磷酸酶,底物 酶,初级反应产物-不易扩散,重氮盐,最终反应产物
2、-呈色,偶氮偶联法 Gomori萘酚磷酸酯法-AKP在碱性条件下将-萘基磷酸钠水解出-萘酚,随后-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联,形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】-萘基磷酸钠,蒸馏水,5%四硼酸钠,10%硫酸镁,固蓝B盐 六偶氮对品红与-萘酚偶联-以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红。(偶联人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚,后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素)【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO),Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液,六偶氮对品红,【操作步骤】1.小块组织液氮骤冷,低温冰箱切片2.甲醛钙液(F
3、ca)固定5分钟,4,然后蒸馏水洗,也可不固定3.作用液560分钟,37或室温4.蒸馏水洗5.4%甲醛固定15分钟2小时,室温6.自来水洗,蒸馏水洗7.1%甲基绿(氯仿洗过)510分钟,蒸馏水洗8.甘油明胶封片,或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色,酶的种类,1.氧化还原酶 2.转移酶 3.水解酶 4.裂合酶 5.异构酶 6.合成酶,水解酶-一类增加或去除水,催化水解反应的酶 AB+H2O AH+BOH,(一)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)又称碱性磷酸单酯酶()在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适PH 9.29.4
4、 激活剂:如Mg+,Mn+,某些氨基酸等 抑制剂:氰化物、砷酸盐等 分布:广泛存在于机体组织,常见于具有活跃转运功 能的细胞膜内,如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞,肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘 应用:1.肝脏病、白血病的研究诊断 2.骨的发生和代谢疾病的研究中,显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca+磷酸钙 磷酸钴 硫化钴【孵育液】2%巴比妥钠,3%-甘油磷酸钠,2%无水氯化钙,5%硫酸镁,AKP,【操作步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片 2.不固定切片直接进作用液,或用1%氯化钙Formalin(Fca)固定5分钟2
5、 小时,4,蒸馏水洗 3.作用液1060分钟,37 4.蒸馏水洗 5.2%硝酸钴1分钟 6.蒸馏水洗 7.12%硫化铵1分钟 8.蒸馏水洗 9.甘油明胶封片,或脱水,透明,中性树胶封片【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X100,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X200,(二)酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解 最适PH 为4.85.2 抑制剂因组织差异而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛 分布:主要位于溶酶体内 应用:前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+)Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+)尤文氏
6、瘤,成骨肉瘤等(-),显示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸铅法【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅(黑色)【孵育液】硝酸铅,巴比妥-硝酸盐缓冲液,-甘油磷酸钠【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色2.同时偶联法【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联,在酶活性处形成红色的不溶性复合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮对品红,ACP,【操作步骤】1.新鲜组织低温冰箱切片2.不固定或吹干后丙酮固定15分钟3.用孵育液置于37水浴箱12小时4.流水洗,晾干(12分钟)5.用Mayer苏
7、木精或1%甲基绿复染6.流水洗10分钟7.常规脱水透明,中性树胶封片【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色.胞核兰色(苏木精复染)或绿色(甲基绿复染),涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶 X400,(三)5核苷酸酶(5nucleotidase)催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5位置水解磷酸酯的水解酶 最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5,睾丸、脑、肝分别为8.5、7.58.5、8.0 激活剂:Mg+,Mn+抑制剂:氟化钠(0.1M NaF),硼酸钠,OH,OH,H,O,H,OH,H,OH,H,碱基(嘌呤、嘧啶),(H),+H2O,Pi,5Nase,HO-CH2,O,H,H,OH,H,OH,(H),H,碱基,
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