酵母杂交技术原理及应用.ppt

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1、目的基因的分离,目的基因的功能克隆,序列克隆法,筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术,利用差示分析法分离目的基因克隆,DNA插入诱变法分离目的基因,根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆,目的基因的功能克隆,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术分离出一定发育时期的特异蛋白应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列，推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作为探针从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因,将分离纯化的特定编码蛋白作为抗原，利用免疫动物制备抗体用特异的蛋白质抗体筛选含有目的基因插入序列的cDNA表达文库，分离出含有目的基因的克隆。,在平板上涂布文库和制备硝酸

2、纤维滤膜的拷贝然后将滤膜处理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白，在将滤膜放入含有抗体的溶液中，温育一定时间后，洗去未结合的抗体，在加入第二抗体或葡萄球菌蛋白A。第二抗体是用放射性同位素或生物素或酶标记的，通过该标记找到表达产物能与抗体结合的克隆，从而筛选出目的cDNA克隆。,返 回,自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性，这样就使核酸的种间杂交成为可能。已知组蛋白在因、肌动蛋白基因及-神经生长因子（-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探针，并已成功地用于分离相关的基因。在同一蛋白质家族内，也存

3、在着具有共同氨基酸序列的区段，即所谓的保守区。这些保守区往往是由彼此相邻的6-7个氨基酸组成，这样的长度显然适合于推导合成寡核苷酸探针库，用来分离编码相关蛋白质的cDNA。,序列克隆法,根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因,表达序列标签法分离目的基因ESTs,基因表达序列分析法,返 回,利用差示分析法分离目的基因克隆,mRNA差别显示技术,mRNA差别显示技术,抑制性减法杂交技术,返 回,酵母双杂交,酵母双杂交系统的建立,酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子

4、往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域(DNA binding domain，简称为BD)和转录激活结构域(activation domain，简称为AD)，BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能（如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录）,如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那

5、么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。,1）将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein（诱饵蛋白）的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。2）将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母（这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。）3）当上述两

6、种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。,主要有二类载体:a 含DNA-binding domain的载体；b 含DNA-activating domain的载体。这二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-loc

7、alization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147)；LexA(E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。,酵母双杂交系统的建立,酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株具有许多优点:1 易于

8、转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA结合结构域(如 GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。,酵母双杂交系统的建立,酵母双杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:1、视已知蛋白的cDNA序列

9、为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。,酵母双杂交系统的建立,酵母双杂交系统的建立,酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进

10、行多次洗涤，降低了信号强度。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。,酵母双杂交系统的优点和特点,酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂

11、交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。,酵母双杂交系统的应用,1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，

12、也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。,酵母双杂交系统的应用,2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。,3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止

13、它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。,酵母双杂交系统的应用,4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分

14、析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义,酵母双杂交系统的应用,酵母双杂交系统局限性和存在的问题,酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞

15、外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生假阳性结果。,在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。,酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白

16、质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。,酵母单杂交,用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结

17、构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。,酵母单杂交系统的原理,正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2 部分组成：(1)将文库蛋白片段与GAL4 转录激活域 融合表达的cDNA 文库质粒；含有目的基因和下游报告基因的报告质粒.首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.,酵母三杂交系统的原理与酵母双杂交相似，利用了酵母细胞的GAL4蛋白调节目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)转录的特点。GAL4蛋白具有两个可分离的功能区，N端是DNA结合结构域，C端为转

18、录激活结构域。只要这两个相对独立的结构域能够通过一定的方式在空间上足够的靠近(如借助其他分子的相互结合使其足够靠近)，即使它们之间没有共价结合也可激活转录，这为研究蛋白质与其他分子的相互作用提供了可能。,酵母三杂交的原理,上图显示了酵母三杂交系统的原理。在酵母三杂交系统，lexA启动子调控下游LacZ基因和His3基因的表达，而lexA启动子的激活取决于DNA结合结构域和转录激活结构域能否在空间上相互靠近。其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另

19、一部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测半乳糖苷酶的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及半乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。,噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌

20、体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，为筛选到目的蛋白或多肽奠定了基础。,噬菌体展示技术,原理 噬菌体展示技术是将外源DNA 通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA 片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。

21、,类型 1 丝状噬菌体展示系统 丝状噬菌体属于单链环状DNA 病毒，编码10种蛋白质，其中与噬菌体展示有关的是p 和p 衣壳蛋白。p 蛋白位于噬菌体颗粒的一端，有3 个5 个拷贝，可在N 端、近N 端或N 端与C 端的柔性连接区融合外源肽或蛋白质。p 蛋白对展示的外源多肽或蛋白质的大小无严格限制，但由于p 蛋白的拷贝数只有3 个5 个，在免疫学和生物疫苗研制中受到了限制。p 蛋白位于噬菌体颗粒的两侧，一般在N 端或近N 端融合外源序列。由于p 分子较小，只能融合较小的外源肽段，携带肽段太大会影响外壳的组装，使其失去感染力。但它的拷贝数多，因此该系统一般用于筛选亲和力较低的配体，高拷贝p 蛋白在

22、疫苗开发上具有潜在的应用价值。,2 噬菌体展示系统 噬菌体是最早使用的克隆载体，其两端为不闭合的线形双链DNA，末端为长12 个核苷酸的互补单链。噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体头部组装必需的D 蛋白的N 端或C 端，或主要尾部蛋白PV 的羧基端折叠区(非功能区)，实现外源蛋白的表面展示。噬菌体是在宿主细胞内完成装配的，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白(100 ku 以上蛋白)及对宿主细胞有毒性的蛋白，适用范围极广。,3 T4 噬菌体展示系统T4 噬菌体展示系统是将外源肽/蛋白质与T4噬菌体的小外衣壳蛋白C 端融合而被展示，展示方法是利用一个选择性载体(或称之为

23、整合载体)，将融合有外源序列的小外衣壳蛋白(small outer capsidprotein,SOC)融合基因同源整合入缺失SOC 的T4 基因组中，选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体，即可将外源肽/蛋白质展示于噬菌体表面。SOC具有与噬菌体颗粒表面专一结合的能力，因此还可用体外组装的方法实现展示。方法是将SOC 及其融合衍生物在大肠埃希菌中表达，然后分离该融合蛋白，纯化后，加入到缺失SOC 的噬菌体颗粒或多聚头部，结合后即可达到展示目的。T4 噬菌体载体可以体外组装且系统容量大(35 ku 以上)，拷贝数高，但由于其采用的是C 端融合，这对研究蛋白质N端的功能不适合，而使它在蛋白质生物研究

24、中的应用受到局限。,4 T7 噬菌体展示系统 T7 噬菌体衣壳蛋白通常有两种形式，即10A(344 个氨基酸)和10B(397 个氨基酸)，独特的10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用作噬菌体展示。展示在T7 噬菌体表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围较广。T7 噬菌体展示系统可以在其表面以高、中、低拷贝表达各种蛋白。极高拷贝数载体适合用于低亲合力的结合域，中拷贝展示载体适合用于分析中等亲和力的结合域，低拷贝数载体适合用于分析高亲和力结合域。T7 噬菌体展示系统是通过C 端融合表达蛋白，插入片段被克隆到T7 噬菌体载体基因10 的C 端。因此，即使插入

25、片段内含有终止密码子，同样也可以被其表达和展示。,关于实验溶液1：由葡萄糖，EDTA 和Tris.CL组成。葡萄糖的作用是增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA，EDTA 的作用是络合Mg2+等二价金属离子。防止DNA酶对质粒的降解，Tris能是溶菌液维持溶菌作用的最适ph范围。溶液2：由SDS和NaoH组成。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性，NaoH的作用是破坏氢键，使DNA变性溶液3：由KAc与HAc组成，是ph为5.5的高盐溶液。能中和溶液2的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质。很容易与小分子的质粒DNA分离。此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。,