TDFTM005-2023 大方天麻萌发菌、蜜环菌生产技术规范.docx

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1、团体标准T/DFTM0052023大方天麻萌发菌、蜜环菌生产技术规范（征求意见稿）2023-XX-XX发布2023-XX-XX实施大方县天麻协会目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14生产环境要求25菌种来源及品种26菌种采集及分离37母种制备38二级种异体化制备49原种制备610栽培种制备611菌种贮藏及运输712质量要求713记录入库7参考文献8本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由大方天麻协会提出并归口。本标准起草单位：大方县市

2、场监督管理局、大方县农业农村局、大方县林业局、大方县工业和信息化局、贵州九龙天麻有限公司、贵州乌蒙腾菌业有限公司、贵州同威生物科技有限公司、大方县丽军林下种植中药材专业合作社、大方县汉铮天麻种植专业合作社、大方县三合森源中药材种植专业合作社、大方县好山珍生态农业专业合作社。本标准主要起草人：大方天麻萌发菌、蜜环菌生产技术规范1范围本文件规定了大方天麻萌发菌、蜜环菌菌种生产的术语和定义、生产环境、菌种来源及品种、菌种采集及分离、母种制备、二级种异体化制备、原种制备、栽培种制备、菌种贮藏及运输、质量要求、记录入库等技术要求。本文件适用于大方天麻萌发菌和蜜环菌菌种的生产。2规范性引用文件下列文件中的

3、内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB150.2压力容器第2部分：材料GB50073洁净厂房设计规范NY/T1731食用菌菌种良好作业规范NY/T1935食用菌栽培基质质量安全要求NY/T2375食用菌生产技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1萌发菌为小菇属(Mycena)的一类真菌，通过菌丝浸染天麻种胚，为天麻提供营养促进天麻生长，大方天麻萌发菌生产主要以石斛小菇(叱dendrobiiFanetGuo)为主。3.2蜜环菌为白蘑科蜜环菌属

4、Armillaria的一类真菌，为天麻提供生产所需的营养，是保证天麻正常生长的共生真菌。大方天麻蜜环菌选用的是来自大方县野生自然环境分离培养出的优质蜜环菌(,Armillariamellea)。3.3母种经各种方法选育得到的菌丝体纯培养物及其继代培养物。也称一级种、试管种。3.4原种由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。也称二级种。3.5裁培种由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。也称三级种。3.6菌索真菌菌丝体集合而成的绳索状结构。4生产环境要求3.7 生产环境应符合GB50073、NY/T1731的要求。3.8 生产车间应配置有独立的萌发菌

5、、蜜环菌菌种生产车间，菌种生产车间应设置有相应的场地和设备，包括原辅料仓库、原料处理场、洗涤室、配料室、灭菌柜、冷却间、净化接种车间、培养室、质检室、保藏室、贮藏库、紫外线灯等，场地布局科学合理，方便操作。3.9 操作规范应符合NY/T1731的要求。4. 4基质质量应符合NY/T1935的要求。其中，培养菌种所用的木屑、树枝应选用壳斗科、桦木科、大风子科、蔷薇科、豆科等不含芳香油脂的树种，一般选择青冈、板栗等阔叶树种，主料及辅料应新鲜、洁净、无霉变、无虫害等。4.5生产资质应符合食用菌菌种管理办法中华人民共和国种子法相关规定。5菌种来源及品种5. 1菌种来源5.1.1 野外采集：采集自大方当

6、地天麻野外林下种植区正常生长发育的菌株，所选菌株应与天麻具有亲和力，适宜天麻种植。5.1.2 外购：用于扩繁生产销售的菌株，应从具有一级或二级生产许可证单位引种。不应使用来历不明、种性不清、随意冠名的菌种和生产性状未经系统试验验证的组织分离物作种源生产菌种销售。5. 2菌种品种萌发菌：石斛小菇QLdendrobiiFanelGuo)；蜜环菌：高卢蜜环菌(4gallic粗柄蜜环菌(4Cepistjpes)等。6菌种采集及分离5.2 萌发菌5.2.1 采集时间：每年6月8月。5.2.2 采集分离：采集大方天麻野生林下种植区天麻种子萌发形成的原球茎作为分离材料，对其进行分离和培育，获取萌发菌种菌。5

7、.3 蜜环菌6. 2.1采集时间：每年9月11月。6. 2.2采集分离：一蜜环菌菌索：雨晴之后，采集大方天麻野生林下种植区，枯树枝或枯树桩上白色生长点及红色幼嫩的蜜环菌菌索作为分离材料；或者将有蜜环菌菌丝的枯树枝、枯树桩带回室内培养，待其长出蜜环菌菌索后，将幼嫩菌索作为分离材料。 带菌索的天麻块茎：在天麻采收季节，挑选健康的、带菌索的麻种或营养繁殖茎作为分离材料。 蜜环菌子实体：在天麻野外林下种植区或野生蜜环菌生长的地方，采取发育正常、无病虫害、尚未开伞的子实体作为分离材料。 抱子：收集蜜环菌子实体成熟后散出的抱子作为分离材料。7母种制备7.1 PAD培养基制备7.1.1 培养容器：使用玻璃试

8、管，玻璃试管的规格一般使用18m180mm或20mm200mm。7.1.2 管口填塞物：要求使用普通棉花或硅胶塞，不能使用脱脂棉。7.1.3 培养基：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水100Om1,均匀混合。7.1.4 培养基灌入：萌发菌:试管倾斜灌入,灌入量为试管总体积的1/41/5,培养基斜面顶端距棉塞40mm50mm。蜜环菌：试管直立灌入，灌入量为试管总体积的1/22/3,培养基顶端距棉塞40mm50rn7.2 萌发菌母种制备选取健壮的原球茎，清除泥土，用自来水冲洗干净，然后用无菌水冲洗数次后，置于经灭菌处理的培养皿中，用0.整氯化汞溶液浸泡3min5min,用灭菌小剪刀将原球

9、茎剪成2段3段，在链霉素液中蘸一下，接入PDA培养基中，25C培养5d10d,待发出菌丝后，挑取菌丝接入新的PDA培养基中，25C培养5d10d,如此反复几次，即可得到纯化的母种。7.3 蜜环菌母种制备7.3.1 菌索制备法：切取部份蜜环菌菌索组织，用无菌水冲洗2次3次，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡0.5minlmin,再次用无菌水冲洗2次3次，洗去残存的药液，在链霉素液中蘸一下，用无菌淀纸吸干表面附着水后，接入PDA培养基中，在25恒温培养3d4d,培养至接种点处刚产生菌丝分枝时，立即用接种铲截取其中生长旺盛且幼嫩的菌丝顶端部分，接入PDA培养基中，25恒温避光培养，菌丝长满培养基后即得纯化

10、的母种。7.3.2子实体制备法：清除蜜环菌子实体表面泥土,切除菌柄基部，用75%酒精擦拭表面2次3次,将子实体撕开，在菌盖和菌柄交界处或菌褶处挑取小块组织接入PDA培养基中，在25培养517比在接种处刚产生菌丝分枝时，同菌索制备法进行培养和分离获得纯化后的母种。7.3.3胞子制备法：开伞的子实体截去菌柄的下半部，用75%的酒精擦拭表面2次3次，然后将菌褶向下插在抱子收集装置支架上，将支架置于无菌培养皿中，盖上钟罩，收集狗子。待抱子落于皿内后,用无菌水制成抱子悬液接种于PDA培养基，在25C恒温培养3d4d天，在接种处刚产生菌丝分枝时，同菌索制备法进行培养和分离获得纯化后的母种。8二级种异体化制

11、备8.1 异体化制备设备及设施主要生产设备：包括液体菌种发酵罐、空气压缩机、高效空气过滤器、高压蒸汽灭菌锅、净化工作台、（恒温）电磁摇床、玻璃三角瓶等。液体菌种发酵罐、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应符合GB150.2的规定；高效空气过滤器对粒径0.10.2Uln粒子的捕集效率在99.999%以上；玻璃三角瓶500ml-2000ml,耐126C高温灭菌。-主要基础设施：液体菌种生产车间应包含配料间、灭菌室、净化冷却间、净化接种间、发酵间、化验室等，并配备相应设施设备。8.2 培养原料化学试剂类、生物制剂及天然材料类应符合NY/T2375要求，同时水不溶物物料需过100目筛。8.3 摇瓶菌种制种8.4 3

12、.1萌发菌摇瓶推荐配方土豆淀粉5gL,酵母膏3gL,葡萄糖20gL,琼脂粉lgL,磷酸二氢钾lgL,硫酸镁0.5gL,维生素Bl10mgL,水100Om1。土豆淀粉3gL,玉米粉2.5gL,黄豆粉L5gL,肽基粉7.5gL,葡萄糖20gL,红糖5gL,磷酸二氢钾lgL,硫酸镁0.5gL,维生素BlIoIng/L,水IOooinL8.5 .2蜜环菌摇瓶推荐配方玉米粉7gL,黄豆粉6gL,葡萄糖20gL,磷酸二氢钾2gL,硫酸镁lgL,蛋白陈2gL,酵母膏2gL,维生素Bl10mgL,水IoOom1。马铃薯（煮后取滤液）200gL,数皮15gL,葡萄糖20gL,磷酸二氢钾3gL,硫酸镁L5gL,维

13、生素BI10mgLo栋木树枝（煮后取滤液）Ioog/L,蔗糖20gL,磷酸二氢钾3gL,硫酸镁L5gL,维生素Bl10mgLo8.6 3.3摇瓶培养基配制及灭菌按配方称量试剂物品，将试剂置于烧杯中加水，玻璃棒搅匀。含有树枝、木屑、马铃薯、麦熬、玉米粉等物质的配方，应将物料煮后取滤液。配制好的培养基，分装到三角瓶中，瓶中放置一颗搅拌子。盖上硅胶塞或棉塞，用牛皮纸将瓶口扎好。移到高压灭菌锅，在恒定1221C,恒定压力0.15MPa的条件下灭菌40min08. 3.4接种培养待冷却后，在超净工作台上无菌条件下接入相应菌种的试管母种2mm左右大小接种块56块，并盖好塞子，用牛皮纸扎口。在三角瓶上贴好标

14、签，注明名称，接种日期，然后移到摇床，调整摇床转速到120rin,在25C条件下进行避光培养6d8d即可得到液体原种，得到液体摇瓶菌种后，需要及时接入发酵罐或栽培种中。定时观察培养液颜色，菌球形态，如发现异常立即进行鉴定（如测pH,镜检菌丝，取样培养）。将培养好的液体种子进行综合检测后供给发酵罐进行接种，待发酵罐接种后同时对液体种子进行镜检、空培养、取样。8.4发醉罐生产技术8.4.1发酵罐的清洗和检查生产前都必须对罐内进行彻底清洗。清除罐壁上菌球、菌块、菌皮、料液及其它污垢，用清水冲刷干净。检查各个阀门、加热管、电控系统、气泵、压力表等是否正常，如有故障及时排除。8.4.2煮罐空消对罐体内部

15、进行彻底消毒。加水至视镜中线，扣紧接种盖，关闭排气阀，打开启动开关，当温度达到100时，排气阀微开。温度达到121C时计时40Inin,关闭排气阀，闷20min后放水。放水结束后，再用水从进料口反复刷罐数次，使罐内残存物排放干净。8.4.3培养基制作与上料以推荐的摇瓶菌种配方基础，乘以罐体最大可利用容积，最终得到发酵罐的配方。配方配置方法与摇瓶液体菌种配置方法相同。8.4.4培养基灭菌关闭罐门后，打开启动开关，当温度达到100C时，排气阀微开，温度达到121C时自动计时40min0在灭菌过程中，为避免阀门处成为灭菌死角，需要在保压过程中每隔15min排料一次，共3次，每次排料3min5min。

16、8.4.5降温灭菌结束后将夹层进水阀门打开通水冷却。当发酵罐压力降至0.1MPa以下，进气系统气压高于罐内压0.02MPa以上时，慢慢打开进气阀向罐内送气。罐内温度降至28C以下时即可进行接种操作。8.4.6接种用75%酒精将接种口的外盖和周围，打开排气阀，当罐压降到接近于零时，迅速关闭排气阀并点燃接种口的缠绕有浸湿酒精棉花的铁环。在火焰保护下，打开接种口盖，将摇瓶菌种瓶口在火焰上适当灼烧消毒，打开摇瓶塞子，迅速将摇瓶菌种倒入发酵罐内，并迅速的将盖子在火焰上灼烧后盖上，旋紧接种盖。罐内升压后用湿毛巾灭掉火圈，打开排气阀，调整罐压在0.05MPa左右进行培养。8.4.7培养设置温度231,培养4

17、8h后，每隔Ih2h自接种阀取样一次（或通过透视窗察看），观察菌种萌发和生长情况。蜜环菌、萌发菌的液体发酵罐培养周期6d7d,菌丝生长期的菌丝体生活力最旺盛，菌丝体相互缠绕形成球的菌球，直径约0.1Cln0.3cm,发酵液中菌球颗粒约占80%-90%,菌液颜色变黄色，菌球与菌液界线分明，判定达到放罐接种的最佳时期。8.4.8转接到栽培种对接种管道进行消毒灭菌，消毒完后将待接种的栽培种（菌棒）放置于接种器输送带，输送至接种器的接种室内。在在洁净的百级净化接种区，用接种枪将液体菌种注入栽培种菌袋。接种动作迅速、准确，接种量为20ml25d袋。8.4.9液体菌种贮藏液体菌种在培养完成后必须ld2d内

18、全部放罐接种，不得贮存过长时间，在发酵罐内通入无菌空气，保持罐压0.05MPa时，料温10C左右可保存2d,15C可保存1do9原种制备9.1 培养基质制备9.1.1 培养容器：使用550ml或650ml的玻璃瓶为菌种瓶。9.1.2 基质封口：使用硅胶塞。9.1.3 推荐培养基质：萌发菌：阔叶树锯末77.5%、效皮15%.玉米粉5%、葡萄糖现、石膏粉1%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.2%。蜜环菌：阔叶树木屑87.5%、效皮10%.葡萄糖1%、石膏粉%磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.2%o9.2 萌发菌原种制备将萌发菌原种培养基质混匀，加水至含水量在65%70%,装入菌种瓶，以装满整瓶为度，盖上

19、硅胶塞，高压灭菌2.5h3h或常压灭菌8h10h后，移入预冷室冷却至室温，转入无菌接种箱，接入萌发菌母种，23C2C避光培养至菌丝长满整个培养基质后，获得萌发菌原种。9.3 蜜环菌原种制备将蜜环菌原种培养基质混匀，加水至含水量在65%70%,装入菌种瓶，以装满整瓶为度，盖上硅胶塞，高压灭菌2.5h3h或常压灭菌8h10h后，移入预冷室冷却至室温，转入无菌接种箱，接入萌发菌母种，23C2C避光培养至菌丝长满整个培养基质后，获得萌发菌原种。10栽培种制备10.1 培养基质制备10.1.1 培养容器：使用厚度20.04mm,容积550nd或650Inl的聚丙烯、聚乙烯菌袋或菌瓶。10.1.2 基质封

20、口：使用塑料螺纹环圈盖或用棉线扎紧、菌瓶用硅胶盖。10.1.3 推荐培养基质：一一萌发菌：阔叶树木屑50%,熬皮9%,棉籽壳40%,石膏1%。阔叶树树叶90%,熬皮9%,石膏1机蜜环菌：阔叶树木屑87.5%、数皮10%、葡萄糖巡、石膏粉1%.磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.2%o青冈、板栗等阔叶树树枝100%o阔叶树木屑74%,熟皮5%,玉米粉10%,棉籽壳10%,石膏1机10.2 萌发菌栽培种制备按推荐培养基将原料混合后，加水至含水量60%70%,装入菌袋，以装满菌袋能扎紧袋口为度，高压灭菌2.5h3h或常压灭菌12h14h后，冷却后在无菌条件下接入相应的原种或将萌发菌母种直接接入萌发菌栽培种

21、培养基质中，置于232避光培养，菌丝长满整个培养基后，即获得萌发菌栽培种。培养期间适时通风，剔除感染。10.3 蜜环菌栽培种制备10. 3.1蜜环菌枝条菌：选用100%树枝为培养基质，将直径0.5Cln1.5cm的树枝截成1.5Cm2.5cm的小段，在水中浸泡48h,使树枝充分吸水后装入菌袋（瓶），装入量以袋容积的4/5为度，再加水至袋口后封盖，高温灭菌后接入蜜环菌原种或将蜜环菌母种直接接入蜜环菌栽培种培养基质，232避光培养至菌索长满所有培养基质，获得蜜环菌栽培种。培养期间适时通风，剔除感染。1.1 3.2蜜环菌固体干菌：按推荐培养基将原料混合后，加水至含水量60%70%,将蜜环菌栽培种培养

22、基质装入菌种袋，装袋以容积的4/5为度，压紧培养料并封口，经高压灭菌2.5h3h或常压灭菌12h14h后，移入预冷室冷却至室温，转入无菌接种箱，接入蜜环菌原种或直接接入母种，23C2C避光培养至菌丝长满整个培养基质后，获得蜜环菌栽培种。培养期间适时通风，剔除感染。11菌种贮藏及运输1.2 母种萌发菌和蜜环菌贮藏运输条件相同，获得母种后，于Ie4C洁净的冰箱或冰柜中冷藏和运输。1.3 原种、栽培种萌发菌和蜜环菌贮藏运输条件相同，获得原种和栽培种后，于通风凉爽、干燥、洁净，温度25C的条件下贮藏和运输。12质量要求12.1 母种质量萌发菌母种菌丝应长满斜面培养基，粗壮均匀，无杂菌和异味。蜜环菌母种菌丝应长满直面培养基，粗壮均匀，有锁状联合，无杂菌和异味。12.2 原种、栽培种一萌发菌：菌丝长满基质、白色呈絮状，菌袋洁白，上下基本一致，袋口处气生菌丝旺盛，质地富有弹性，结构紧而不散。袋内不得有除萌发菌外的其他真菌的菌落生长。蜜环菌：菌丝长满基质，菌包白色至棕褐色，袋内菌丝粗壮、分支多、密、分布均匀、弹性好,部分表面棕褐色菌索出现，菌索顶端具白色生长点。袋内不得有除蜜环菌外的其他真菌的菌落生长。13记录入库制备好的菌种，经检验合格后及时入库。生产中各环节应详细记录备案。参考文献1、原国家农业部令第62号食用菌菌种管理办法（2015年修订）2、中华人民共和国种子法（2022年修订）