遗传病的诊断与治疗lsy.ppt

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1、第17章 遗传病的诊断,由于遗传病的治疗还没有理想的方法，目前临床遗传的重点是如何诊断遗传病，特别是产前诊断，以达到防止有遗传缺陷的患儿出生。遗传病的诊断是一项复杂的工作，需要多学科的配合。,第一节 遗传病的临床诊断,普遍性原则遗传学的诊断手段产前诊断、症状前诊断、现症患者诊断,一、病史采集1.家族史2、婚姻史3.生育史,二.体格检查 围绕遗传病的特征,三.系谱分析1.系谱的系统性、完整性、可靠性 单基因，多基因；显性，隐性；常染色体，性染色体。表现度、外显率、隔代遗传、发病风险。2.注意延迟现象3.新发的基因突变4.显性与隐性的相对性,四.遗传数据库资源应用,第二节 细胞遗传学检查,一.染色

2、体检查：核型分析标本：外周血、绒毛、羊水、活检组织。分带：Q-，G-,R-,C-,荧光原为杂交(FISH)分析：数目(单体、多体)、结构（易位、缺失、倒位)二、性染色质检查 数目和结构,染色体检查指征：明显生长发育异常、多发畸形、智力低下者；多发性流产和不育的夫妇；已经生有染色体异常患儿的夫妇；性腺以及外生殖器发育异常者；原发性闭经；35岁以上的高龄孕妇；身材高大，性情粗暴的男性；恶性血液病患者；长期接受X线、电离辐射的人员。,染色体检查,生化检查主要用于生化遗传病的检测。主要针对三方面：1）蛋白、酶活性；2）反应底物、代谢中间产物或终产物的浓度；3）受体的结合能力。例如疑为苯酮尿症患者，可检

3、测血清苯丙氨酸或尿中苯乙酸浓度。,第三节 生化检查,常见通过酶活性检测的遗传代谢缺陷病(1),生物化学检查,常见通过酶活性检测的遗传代谢缺陷病(2),生物化学检查,部分通过血清和尿液检测的遗传代谢缺陷病,生物化学检查,第四节 基因诊断,基因表达调控,基因的表达鉴定,DNA水平：基因表达调控：1、DNA甲基化2、组蛋白修饰：乙酰化，磷酸化3、其它,DNA甲基化导致基因沉默基因之“锁”,沉默,启动子区,转录,转录,Pol II,疏松开放,致密封闭,Southern：1975年，英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术,基因的表达鉴定,RNA水平：RT-PCR。PCR：1985年，Ka

4、ry Mullis发明了PCR表达谱芯片,Northern blot，1977年检测RNA的表达水平 mRNA 直接跑胶，转膜，杂交。,基因的表达鉴定,Protein：Western,第0代遗传标记:1、滴血认亲2、血型分析,第一代遗传标记：限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，缩写RFLP，DNA指纹)：DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小,第二代遗传标记：短串联重复序列STR,第三代遗传标志：单核苷酸多态性（SNP）：,分子诊断的特点,针对直接病因诊断特异性强，灵敏度高适应性强，诊断范围广目的基因是否处于活化状

5、态均可，无组织和发育特异性。在感染性疾病的基因诊断中，可检测正在生长的病原体或潜伏病原体。,可以是任何有核细胞，包括：1、外周血白细胞、口腔粘膜细胞2、活检标本、石腊包埋的组织块3、沉淀细胞（唾液、痰液、尿液）4、羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎儿细胞(应用PCR，样本可微量化到一个细胞),分子诊断的材料,限制性片段长度多态性分析（RFLP）核酸杂交(Southern)聚合酶链反应(PCR)DNA测序 基因芯片技术 其它常用的技术（1）PCR-RFLP（2）PCR-ASO（3）PCR-SSCP,分子诊断的基本技术,Southern印迹杂交原理,基因组DNA,DNA片段,杂交,结果分析,酶切

6、,探针,Southern流程,Southern blotting,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,Southern诊断示例：-地中海贫血,Southern blotting,/-/-/-/-,14kb,10kb,正常 缺1 缺2 缺3 缺4,Southern诊断结果分析,RFLP原理,RFLP:Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性,Southern-RFLP,Mst II识别序列 Mst II 1.2 kb CCTGAGG CCTGTGG,probe,1.4 kb,x,RFLP诊断:镰状细

7、胞贫血症,0.2kb,1.4 kb 1.2 kb/S S/S 正常 镰状 镰状贫血,Southern-RFLP结果分析,PCR原理,Kary Mullis,polymerase,dNTPs,镰状细胞贫血(HbS)：第57位密码子,Mst:CCTNAGG,A:CCTGAGGAGS:CCTGTGGAG,PCR-RFLP,PCR-ASO,ASO:allele-specific oligonucleotide,等位特异性的寡核酸探针,正常人 病人,正常探针,突变探针,正常探针：5AAGGCTTAGCTTAGCTTTGGACC突变探针：5AAGGCTTAGGTTAGCTTTGGACC,ASO点杂交检测基

8、因突变举例,PCR-ASO,PCR-SSCP原理,SSCP:Single Strand Conformation Polymorphism,单链构象多态性,PCR-SSCP示例,DNA芯片DNA测序FISH,FISH原理,FISH应用示例,利用FISH技术检测染色体易位,利用FISH技术检测21-三体(R)和13(G)染色体,FISH应用示例,分子诊断的限制因素,分子诊断方法具有无限广阔的应用前景，随着技术的不断进步和诊断成本的不断降低，临床应用越来越广泛。目前限制分子诊断应用的主要因素有：大部分遗传相关性疾病的致病基因还未明确，特别是多基因疾病和具有遗传异质性的疾病；2.成本较高、周期较长；

9、3.遗传学和分子生物学知识还未得到广泛的普及。,第18章 遗传病的治疗,本章主要内容：一般原则，传统方法，基因治疗。,遗传病治疗的原则,遗传病致病的特殊性导致了其治疗方法的困难，因此大多数遗传病至今没有理想的方法，应以预防为主。目前，遗传病的临床治疗只能暂时控制病症的发展，长远效果不理想。遗传病治疗有常规治疗和基因治疗两种。前者一般只能改善其表型，而后者为遗传病治疗带来了新的希望。,治疗的原则：1.针对基因突变进行体细胞基因修饰；2.针对基因表达异常进行调控；3.蛋白质功能改善；4.代谢产物控制；5.临床针对症状的治疗措施。,第一节 手术治疗,手术修复手术去除器官移植 修补、矫正、器官移植。例

10、如，唇裂腭裂的修补；心脏手术，两性生殖器的手术矫形；多囊肾的肾移植；糖尿病的胰岛细胞的移植；地中海贫血的骨髓移植等。,第二节 药物治疗,补其所短去其所余 螯合剂 促排泄剂 代谢抑制剂 血浆置换或过滤 平衡清除法,第三节 饮食治疗,禁其所忌 控制饮食 药物控制吸收早发现，早治疗。,第四节 基因治疗,基因治疗(gene therapy)是一种用正常基因导入靶细胞，校正或置换致病基因的治疗方法。,第一个成功的基因治疗:1990年美国的一个年仅4岁的小女孩（腺甘脱氨酶缺乏症，先天性免疫功能不全）接受了基因治疗而且取得了成功。,策略,1.基因修正（gene correction）2.基因置换（gene

11、replacement）3.基因增补（gene augmentation）4.基因干预（gene interference）,基本流程,1.目的基因的选择和制备2.靶细胞的选择3.目的基因的转移方法4.外源基因的表达与检测,靶细胞的选择 坚固、易增殖、易转化、组织特异性基因转染途径物理法：电击法化学法：转染试剂病毒法：,途径,生殖细胞体细胞 直接整合 体外整合,其它方案,RNA修复剪接控制RNA调控,1990年美国进行了第一例人类体细胞基因治疗。治疗实验是把腺苷酸脱氨酶(ADA)基因引入一名 ADA 缺乏症患儿体内的白细胞，成功地替换了她体内不能产生腺苷酸脱氨酶(ADA)的缺陷基因，从而开创了

12、基因疗法根治人类遗传病的新纪元。,2006年11月20日报道：复旦大学遗传学研究所基因治疗研究组研制的“重组AAV-2人凝血因子IX注射液”获得国家食品药品监督管理局的药物临床研究批件。,Roth 等对6例血友病A患者实施基因治疗：取患者的皮肤成纤维细胞体外培养，通过电穿孔把携带有删除B区域的F基因质粒转染皮肤成纤维细胞，体外培养后，筛选能产生F 的细胞进行克隆，然后在腹腔镜帮助下注入患者的大网膜。随访12个月，4例患者F水平较治疗前提高，并且外源性F使用减少。F水平提高最高的患者，临床症状的改善持续大约10个月，随访期间无明显副作用，未检测出F抑制物。,基因治疗的临床应用,1.表达稳定性较差

13、或丢失，错误RNA，靶细胞寿命短。2.病毒载体的安全性，感染，癌变。3.表达效率不高。4.对病毒载体的免疫排斥。5.伦理问题,尽管目前转基因技术在基因治疗中成功率很低，长期疗效难以确定，安全性、可靠性及伦理等方面存在问题，但是临床基因治疗的成功范例，仍将激励学者们进一步加强这一领域的基础、临床及相应策略的研究。相信未来伴随基因转移、DNA 重组、基因克隆和表达等技术的迅猛发展，基因治疗将成为人类攻克遗传病的一种常规治疗手段。,基因治疗存在的问题,第19章 遗传病的预防,第一节、普查地区、民族、个体等发育史生育史系谱,第二节 遗传筛查,新生儿筛查携带者检出,第三节 遗传咨询,婚前咨询和体检生育咨

14、询和体检评估再发风险对策和措施,产前诊断适应症,夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或者夫妇染色体正常，但出生过染色体异常的患儿的夫妇；35岁以上的高龄孕妇；夫妇之一有开放性神经管畸形，或出生过这种畸形患儿的夫妇；夫妇之一有先天性代谢缺陷，或出生过这种患儿的夫妇；X连锁遗传病基因携带者孕妇；原因不明的习惯性流产的孕妇；羊水过多的孕妇；夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；具有遗传病家族史，又系近亲婚配的孕妇。,产前诊断主要从三个方面进行：遗传物质检查，如染色体检查、基因诊断等；生化检查，如特殊蛋白质、酶、代谢底物、中间产物和终产物等；物理诊断，如B超、X线、胎儿镜、电子监护等。,获取胎儿组织的常用方法：1.羊膜穿刺法2.绒毛取样法3.脐带穿刺4.胎儿镜检查5.孕妇外周血胎儿细胞富集,产前诊断的关键是如何获得胎儿细胞,产前诊断方法,羊膜穿刺示意图,羊膜穿刺,绒毛取样示意图,绒毛取样,本章重点内容,掌握染色体检查的适应症了解遗传病临床诊断方法了解分子诊断所用技术的原理了解产前诊断适应症及诊断方法了解基因治疗策略、途径及方法,