遗传学与生理学结合的方法.ppt

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1、用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产,前 言 对微生物的代谢途径及代谢网络进行有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然是现代生物工程学的一个主攻目标。为了攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完善的细胞生理学、生物化学、分子生物学及生物过程工程等学科的基本状况做一番描述，主要有如下几个话题:,与生物工程相关的氨基酸产生菌的相关途径的研究进展情况，其中必须包括这些途径的代谢调节以及细胞的整个调节网络的研究进展情况。,对所有的相关途径进行详细的代谢流量分析。这涉及到底物进入细胞的碳架物流量，流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量，以及代谢中间产物流出细胞的碳架物流量(the central

2、 and peripheral carbon fluxes)。还原力的流量(redox flux)及能量流量(energy flux)。,以协调和调节的方式对碳架流、氧化还原反应的电子流、能量流进行导向，以提高底物的吸收能力、限制前体物向支路途径的流量、减少中间产物的积累及副产物的形成，还要绕过氧化还原平衡及能量平衡中可能出现的难题。,传统的设计育种(随机诱变加定向筛选)，以及DNA重组技术在设计育种中的应用已经大大提高了微生物对氨基酸的生产能力，但人们对于氨基酸产生菌的生理学与生物化学等 主要领域的基础知识还相当匮乏。目前可从以下几方面理解氨基酸的代谢基础：,具有生物工程学重要性的微生物的基

3、本代谢途径及其对应的酶的性质；酶及其调节方式，途径及其调节方式；中心代谢途径及离心途径代谢流量的定量分析；对跨膜传送(底物吸收和产物分泌)的详尽的了解。,目的产物的合成途径是理解氨基酸生产的前提和核心内容。相关的代谢途径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸的合成的专用途径，也包括提供前体碳架物的途径、从专用途径分流最终导致副产物生成的分支途径、相应氨基酸自身被降解的途径、以及那些提供还原力和代谢能量的途径。,除了以上这些反映代谢途径基本信息的资料外，代谢流量的相对固定的分布以及代谢流量的动力学响应同样是至关重要的。这既涉及到中心代谢途径（提供碳架物质、还原力及代谢能）的代谢流的定量分析，又涉及到特

4、定氨基酸专用的合成途径的代谢流的定量分析。,此外，底物吸收和目的产物输出等有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般工业微生物底物吸收方面的知识是相当欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近年来才受到关注。方向性的跨膜反应的机理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等方面的知识对于理解氨基酸生产过程也是相当重要的。,我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输送方面为数不多的研究工作，以及这方面研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的微生物代谢设计的新进展

5、和新方法。,1.氨基酸生产的代谢基础2.氨基酸生物合成的代谢流量 分析3.底物的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输出4.氨基酸生产的代谢设计,氨基酸生产的代谢基础1.1 氨基酸的生物合成1.2 代谢产物生产的生理学,1.1 氨基酸生产的代谢基础 氨基酸的生物合成涉及以下5个方面：（1）底物吸收；（2）进入中心代谢途径前的准备途径；（3）经中心代谢途径产生碳架化合物(氨基酸的前体化合物)、还原力(如NADPH、NADH)和代谢能(ATP 和磷酸烯醇式丙酮酸等)；,（4）通过同化(合成)途径将碳架化合物转化成目的氨基酸，此过程涉及到还原力与代谢能的供需平衡，同时也涉及主要载流途径与分支途径之间的关系；（5

6、）目的氨基酸的跨膜输出等；（6）目的产物进一步代谢的途径。,谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成是研究得最为广泛的。图 2 列出了谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物合成相关的途径及重要步骤的代谢调节情况。,图1.微生物细胞合成氨基酸的相关途径及代谢调节示意图,其中，各相关酶及途径水平上的代谢调节，以及整个细胞水平上的全局调节对于代谢流的导向和改造是至关重要的。对微生物整个代谢网络进行有目的的改造和设计涉及到大范围的遗传改造。,该同化(合成)途径通过草酰乙酸(OAA)与中心代谢途径相接，天冬氨酸是该族氨基酸的共同前体物。来自回补途径及TCA环的草酰乙酸，进入合成途径并在天冬氨酸-半醛(ASA)处分为两条支路，

7、一条通往赖氨酸，另一条通往苏氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天冬氨酸激酶(AK)，其他重要的酶包括高丝氨酸脱氢酶(HDH)和苏氨酸脱氢酶(TDH)。,再往后的流量控制点是是通往赖氨酸 DDP合酶(见图中DHDPS)以及赖氨酸的需能输出。要获得令人满意的结果，必须全面考虑这些方面，仅仅对于个别反应(即便是最重要的调控点)进行改造并不是理想的方法，Broer 等曾将脱敏的AK的基因导入野生菌中进行表达，但并未获得很令人满意的赖氨酸产量。,该途径上另一值得关注的特征是从六氢吡啶二羧酸出发合成二氨基庚二酸的旁路途径的出现，借助于 NMR 手段已经得知，旁路的出现依赖于某些代谢条

8、件，特别是可利用的NH4+的存在。,另一个重要的方面是参与特定氨基酸合成途径及与之相关的其他代谢途径的酶的调节特性，包括酶活力的调节和酶的表达的调节。特别是必须详细研究中间产物或终端产物对途径起点或分支处的关键酶的调节。,图2.,天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节.,(其中 表示反馈抑制；表示反馈阻遏),I,R,缩写符号：ASA为天门冬氨酸-半醛，Hse为高丝氨酸，SucAKPA为琥珀酰二氨基庚二酸；AK为天冬氨酸激酶，DDPS为二氢吡啶二羧酸合酶，HDH为高丝氨酸脱氢酶，HK为高丝氨酸激酶，TDH为苏氨酸脱氢酶，AHAS为乙酰羟酸合酶；PEPS为PEP合成酶，PK为丙酮酸激酶，PC为丙酮酸羧化

9、酶，OAADC为草酰乙酸脱羧酶，PEPC为PEP羧化酶，PEPCK为PEP羧激酶。,PYR,AcCoA,OAA,TCA,CTA,HDH,hom,DDPS,dap,A,Asp,Asp-P,AK,lys,C,ASA,Hse,I,Met,DDP,SucAKPA,DAP,Lys,HK,thr,B,Ile,Thr,TDH,ilv,A,AHAS,ilv,BN,I,Thr,Lys,Thr,Met,R,Met,R,Ile，Leu,Val,R,Ile,Ile,EMP,PEP,PEPC,PEPCK,PC,OAADC,PK,PEPS,Glc,G6P,PTS,奇异三角区,I,I,I,要想根据细胞粗提取液的测定结果对这

10、些酶的调控性质做出适当的解释是靠不住的。这一方面是因为它们在这些条件下可能不稳定；另一方面，对于需要什么样的辅因子才能保持它们的活性或(和)它们在缓冲液中的稳定性，也知之甚少；而且特别是因为在抽提的过程中，那些参与胞内酶活性调节的必需因子会丢失。,谷氨酸棒杆菌中存在-酮戊二酸脱氢酶便是一例。人们最初认为这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。正因为如此，才出现了这样的假设，即：TCA 环在该处的中断引起-酮戊二酸的“溢出”，最终导致谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，但是它似乎很不稳定。,另外，在关于代谢流的研究中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中-酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了(

11、dawn-regulated)，但这在细胞抽提物中至今不能得到证实。进行详细的代谢流量(包括相关中间产物的流量)分析，或许是解决这一问题的唯一办法。,正确描述代谢网络的主要节点的调控模式是十分必要的，但常常是十分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、PYR和OAA所构成的“奇异三角区”（magic triangle）是研究的热点。,Glc,PEP,PYR,AcCoA,OAA,G6P,Glc,注：PK,PC,PEPC,PEPCK,OAADC,PEPS,PTS,奇异三角区,PEP通过PYR和AcCoA向TCA环提供C2单位，同时，PEP、

12、PYR 以及 AcCoA 还通过回补反应（通过乙醛酸环）为TCA环提供重要中间产物，这些回补反应对于以TCA环代谢中间产物 为前体的氨基酸的生产来说是非常必要的。,该区包含可能有多达七个酶的参与，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、丙酮酸激酶(PK)、草酰乙酸脱羧酶(OAADC)和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统(PTS)都已得到鉴定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(PEPS)已被假定存在。丙酮酸羧化酶(PC)的存在已得到代谢流量分析的实验数据的支持。,合成代谢途径通常受反馈抑制和反馈阻遏的严格调控，比如 图2 中的AK、HDH、TDH、AHAS等。不过，相对于

13、大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途径的调节还是比较简单的。,研究表明，仅仅研究与合成途径直接相关的酶的调节以及还原力和能量的供给，以及对“瓶颈”处关键酶的解调节或过量表达仍是不够的。中心代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径，同全局调控机制密切相关，如紧缩控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、渗透压调节及生长阶段调节等。这些问题对于氨基酸的合成非常重要，但对它们了解得并不多。,氨基酸的生产中经常用到特定的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，在分成两支的氨基酸合成途径中，一个分支途径的终端产物氨基酸的营养缺陷，通常对另一分支的终端产物氨基酸的合成起促进作用。,(其中 表示反馈

14、抑制；表示反馈阻遏),图3,天冬族氨基酸过量合成的机理,I,R,PYR,AcCoA,OAA,TCA,CTA,HDH,hom,DDPS,dap,A,Asp,Asp-P,AK,lys,C,ASA,Hse,Met,DDP,SucAKPA,DAP,Lys,HK,thr,B,Ile,Thr,TDH,ilv,A,AHAS,ilv,BN,Thr,Lys,Thr,Met,R,Met,Ile,Leu,Val,Ile,Ile,EMP,PEP,PPC,PCK,PC,ODC,PK,PPS,Glc,G6P,PTS,比如图 3 中，谷氨酸棒杆菌中高丝氨酸缺陷或苏氨酸缺陷的赖氨酸生产菌株，大肠杆菌中甲硫氨酸缺陷、二氨基庚二

15、酸缺陷或异亮氨酸缺陷的苏氨酸生产菌株。,R,R,I,I,I,I,I,另一方面，某些化合物对菌体生长的限制，不论是氨基酸或其他化合物(比如磷酸盐),都可能成为有利于特定生物过程的最优控制的技术条件。,尽管连续培养得到的结果表明，赖氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。但在有效分泌的生理条件下，氨基酸生产菌一般都处于生长受限制的状态。,然而，对于与生长限制相关的中心代谢(central metabolism)和外围代谢(peripheral metabolism)的改变如何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；这或许与影响到许多不同的基因和操纵子的调节网络(regulatory networks)的作用

16、有关。,谷氨酸的生产可以建立在完全不同的细胞代谢态势下。许多方法可诱导其分泌，包括生物素亚适量法(用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型)、添加胺类表面活性剂(如吐温40和60)、在菌体生长期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件下生长和采用温度敏感突变株等。,很显然，所使用的这些方法都对细胞质膜或细胞壁有一定影响，但使细胞膜通透性发生变化的机理是不完全一样的。,谷氨酸的分泌曾被认为是因为相对简单和直接的代谢改变（即影响细胞膜性质）的而引起的，然而最近发现在没有紧缩效应的大肠杆菌（rel A 基因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可以触发细胞借助于载体的谷氨酸分泌活性，这表明全局调节机制对分泌

17、的影响是存在的。,1.2 氨基酸生产的微生物生理学对于经氧化还原过程实现氨基酸生产的重要性，早有所认识。但对其中大多数现象（至少在分子水平上）仍未很好理解。对一般的代谢调节现象做如下五点概述，可能将有利于我们从生理学的角度去理解代谢中间产物的生产。,（1）氨基酸的生产与菌体生长之间的关系尚未解决（耦合与否？）。,（2）限制生长条件下的微生物生理。在缓慢生长或非生长条件下，有目的地控制底物的吸收与代谢的速率，能提高发酵工业生产效率。因此，要用分子技术或生化技术对此进行深入细致的研究，以阐明在限制生长条件下，微生物的生理背景同工业发酵过程的应用必定密切相关的道理。,（3）溢出代谢的概念：当这个生理

18、学的新见识同过量生产的特定代谢条件，在分子水平上发生相互关联的时候，溢出代谢(overflow metabolism)的概念是值得关注的。,例如，在过量生产某种产物的代谢条件下，已观察到某些特有的代谢中间产物，如 丙酮酸、-酮戊二酸等会大量分泌。这些特定的代谢中间产物先在细胞内累积(这取决于碳源的性质和生长限制)，然后分泌到细胞外(如果细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机构或有输送系统存在)，从而抵消在碳架物质、还原当量和代谢能等在代谢中的不平衡。,（4）代谢不平衡：细胞的代谢不平衡指碳架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到溢流阀(overflow valve

19、s)的功能。事实上，代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下(如大量氨基酸的过量合成)得以维持，是因为它具备使通常情况下(指碳架物质和代谢能限制的条件下)耦合在一起的代谢流脱钩的灵活性。好几个术语，如“解耦联”、“代谢能溢出”等就是用来说明这种灵活性的。,实际上，曾有人这样描述过细菌的这种行为：“可以推断，细菌对于代谢能过剩的解决办法是把它浪费/用掉”。然而，对特定条件下(如与不生长发生耦合或耦合欠佳的氨基酸的生产条件下)代谢能耗散的机制，尚待进行深入的研究。,在细菌中存在很多能够浪费代谢能的反应和反应组合。如K+或NH4+的无效循环，(在某些情况下也会发生)质子的无效循环。这样的代谢能溢出反应表

20、明，合成代谢与分解代谢之间存在不平衡,而这正是氨基酸生产菌种所希望得到满足的条件。,其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨酸生产的能量溢出问题已有过争论，赖氨酸生产的最大转化率可能受到过量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的高度增加使代谢发生改变，引起代谢能的过剩。因此，可以认为高的能量耗散能力适合于代谢中间产物(如氨基酸)的过量合成。,（5）有关渗透适应性问题：在分批培养的条件下，发酵液中溶质(碳源和能源)的浓度会发生很大的变化，那么了解和控制有关渗透适应性的代谢过程显然就相当重要了。细胞外部渗透压(实际上是水活度)的改变不但对细胞的代谢，而且对底物的吸收、产物的释放都会产生有效的影响。,关于真细菌这方面的

21、基本机制的研究，可能促使我们去选育已丧失以下两种能力的菌株：一是丧失对不利于生产的渗透保护物质（如海藻糖）的合成能力；二是丧失对代谢和输送反应做出渗透压响应的能力。,2.氨基酸生物合成的代谢流量分析 除了代谢途径及其调节机制和已知途径的化学计量分析以外，稳态代谢流量和流量动力学分析对于理解氨基酸生产的代谢网络也越来越重要。,这既涉及到提供碳架物质、氧化还原当量和代谢能的中心代谢途径，也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代谢途径。代谢流量分析和代谢流的动力学分析的一个主要目的在于鉴定代谢网络中所一般认为的限速步骤。,主要可通过两种不同的方法定量地、完整地描述细胞的代谢网络：（1）描述各步反应(酶)的

22、动力学属性及其他有用数据的方法；（2）直接测定底物、产物及一些代表性中间产物的方法，如物料平衡(代谢物平衡技术。,如果要对代谢网络做出完整描述并且对各步反应及其代谢物流量的重要程度做出评价，就要弄清每一个酶的的调节(包括对酶的活性的调节和对表达水平的调节)情况，这当然是不容易如愿的，但已被实践证明，以下简化的策略也可以用来对代谢流进行定量的描述。,第一种方法，在某些场合下用代谢控制理论来对有关生物技术学的研究进行反应动力学的分析。其基本原理就是分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢流量及代谢物浓度的影响，进而确定特定的流量控制系数(flux control coefficients)，该系数反映特

23、定反应对复杂途径的影响程度。,第二种方法，代谢物平衡技术。其模式的推导建立在对底物、产物及某些重要中间产物的直接测定上。这种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖氨酸的研究中得到了应用。如果所研究的代谢网络的途径结构已知，又假定进行稳态代谢，那么就可通过准确测得的所有进出细胞代谢流的流量，推导出特定途径的代谢流量分布。,但用这类方法计算，很难把代谢环路(如TCA环)、重要节点(如 PYR、PEP节点)、以及平衡反应(酶促反应的正向和逆向流量)的特殊重要性包罗在内。这是这类方法的局限性。为了弥补这种局限性，近年已有几种技术用到这种类型的分析中去了。,如采用示踪流量实验(tracer flux exper

24、iments)技术、快速取样技术及核磁共振(NMR)技术可获得关于代谢流分布的另外一些信息，如代谢网络的有关组成部分中的流量分布、胞内不同代谢产物的累积量，以及它们各自随时间而变化的情况。,有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长期、赖氨酸生产期(生物素量足够)及谷氨酸生产期(生物素限量)等条件下胞内代谢流的不同分布情况(下图)，它们以13C标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，然后运用 NMR测定标记了的代谢物，同时运用质量平衡法进行计算，得到了图中的流量分布图或称代谢断面(sections of the metabolism)图。,由图可见，在不同条件下，流量发生了显著的变化。酵解途径的HMP旁路的流量

25、分布在赖氨酸生成时增加，而在谷氨酸生成时则下降。在氨基酸分泌的情况下，回补反应变得更重要一些。,另一个长期以来不能确定的问题也在研究中得到了解决，也就是氨基酸生成条件下GOA环活力的问题，在氨基酸生成条件下，GOA环的活力实测是非常低的。下图为在不同转化率时的理论流量分布图。,课外学习参考资料：Metabolic Pathway Synthesis(p288)Metabolic Flux Analysis(p309)in Metabolic Engineering,1998Metabolic Flux Balance Analysis(p13)in Metabolic Engineering,

26、1999,3.底物的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出 底物的吸收和产物的输出对于氨基酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，特别是大肠杆菌对底物吸收的不同机制已作了详尽的研究，但对于其它生物工程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。,近年的研究表明，在氨基酸生产的条件下，“氨基酸被动扩散跨过细胞质膜”这一设想是武断的。谷氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的输送过程，而且不纯粹是被动的。而运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的重组菌株

27、中，丙氨酸则是依靠简单扩散机制来分泌。,详细了解特定氨基酸跨过细胞质膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过程的效率和转化率也非常重要。尽管采用细菌来生产氨基酸往往可以获得极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未意识到这至少部分是由于细胞向载体系统所催化的分泌反应提供了代谢能的结果。这一点已被有关赖氨酸和异亮氨酸分泌的研究所证实。,下图显示了谷氨酸棒杆菌在异亮氨酸生产过程中发生的不同流量。所观察到的异亮氨酸的净产量实际上是借助于载体而形成的向外分泌的流量、向内吸纳的流量及扩散流量的代数和。,在分批发酵的开始阶段，异亮氨酸从胞内向胞外扩散，但随着胞外异亮氨酸浓度的增加，其扩散方向也发生改变，并越来越多地抵消异亮

28、氨酸载体系统的分泌作用。,这一方面解释了所能获得的最大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜的透性常数，以及分泌和吸收载体的活力；另一方面，由此可看出在生产条件下可能发生由代谢能驱动的分泌与被动回流构成的无效循环是浪费代谢能的。,一般说来，抵消氨基酸的产量的氨基酸的吸收系统对于整个过程并不重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，吸收系统的活力非常低。最近发现，芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的结果是相应氨基酸的吸收的增加，实际上产物的转化率降低了。总之，深入了解氨基酸吸收和分泌的能学及调控的机理对于定量地理解氨基酸的生产过程是极为重要的。,在进行包括输送途径的代谢流量的详细分析时，特别是在比较野生株和生产菌株，

29、或特定菌株在生产或非生产条件下的性质时，已引出了几个重要的概念。,单靠“瓶颈”酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。在通常情况下，仅仅是从底物到产物整条途径的某“瓶颈”酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。对生产菌株的分析表明，为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。只有当一系列酶发生了协调的改变，才能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或积压，避免代谢不平衡或不必要的副反应。,用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酵母菌进行了有关芳香族氨基酸发酵成功的研究。关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌的代谢途径工程研究的成果已见发表。,为提高色氨酸的产量，已对谷氨酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的遗

30、传调节，包括：色氨酸操纵子(已被解除调节的)的基因的过量表达、去除调节子及弱化序列的控制；切断通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、增加前体物如PEP、E-4-P和丝氨酸等的供应、破坏色氨酸酶降解色氨酸的活性等等。,HMP,EMP,PEP,E4P,DAHP,莽草酸,分支酸,预苯酸,邻氨基苯甲酸,Phe,Tyr,Trp,PRPP,Ser,降解产物,大肠杆菌中色氨酸合成途径的简图该图略去了酶活力及基因表达水平上的调控机制，实际上在生产菌株中，这些调控机制都已被解除。,虽然一般用于芳香族氨基酸生产的微生物并不是酿酒酵母，但在概念探讨方面，用酵母进行的色氨酸生物合成的研究是引人关注的。实验结果表明，即使在无分支

31、的途径中，想靠单个酶“上调（up-modulation）”，增加整条途径的流量往往是无济于事的。,正如基于流量控制理论的理论解释，只有几种酶活性协同地提高，才有可能大幅度增加流向色氨酸的全程的流量。这个发现为许多途径中的关于“分摊式的代谢控制（distributive metabolic control）”的更加笼统的描述提供了支持；同时也对仍在广泛使用的代谢途径的所谓“瓶颈”识别方法做出了一个重要的限制。,4.氨基酸生产的代谢设计,氨基酸生产上广泛使用棒状杆菌，这一方面有历史的原因；另一方面，与其他微生物如大肠杆菌相比较，棒状杆菌在工业生产上具有明显的优势。,棒状杆菌的代谢调节相对简单。肠道

32、细菌中特定反应的酶及特定基质的载体系统具有多重性，而棒状杆菌中则没有；棒状杆菌的代谢调控模式也比大肠杆菌要简单得多。然而，利用肠道细菌进行氨基酸菌种的育种的优势则在于可以方便地应用成熟的现代 DNA 重组技术，有效地进行氨基酸生产菌种的改造。,针对于不同的目的和不同水平的复杂性，在考虑代谢设计的策略时应区别对待。代谢设计的目标在于：（1）提高已建立的途径或过程的效率；（2）将代谢流导向至新插入的途径。,第一个目标可通过多种手段来实现：扩展底物利用的范围；改善生长条件；增大通往特定氨基酸合成途径的代谢流；调大通往目的产物的支路和调小通往副产物的支路。,这些对关键酶的活性或调节机制的改良可大大增加

33、最终要被分泌的终端产物氨基酸的胞内浓度。,第二个目标即引入新的途径，以便在不同的代谢期合成新的产物。可通过类似但不同的方法来实现：延长特定的代谢途径；引入新的代谢分支途径；从特定生物引入的全新的途径。,尽管谷氨酸棒杆菌中通往赖氨酸的流量控制点主要分布在天冬氨酸激酶、DDP合成酶和赖氨酸分泌系统，但如果考虑到通往苏氨酸和异亮氨酸的途径，情况就更加复杂了。,二十多年前，曾有人做过把谷氨酸棒杆菌中碳架流导向苏氨酸的开创性研究，其方法是扩增苏氨酸合成途径起始端的两个酶高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶的基因(hom 和 thrB)，以及解除对高丝氨酸脱氢酶的反馈调节。,最近有一项有启发性的研究将一株赖氨酸的

34、生产菌株(出发菌株)逐步转变为苏氨酸生产菌株，其方法是将突变株的hom-thrB操纵子(指为已解除调节的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶编码的操纵子)不同拷贝数整合到出发菌株的染色体DNA上。,尽管出发菌株可有效地分泌赖氨酸及少量的丙氨酸，但当整合到染色体 DNA 上的 hom-thrB操纵子的拷贝数为13时，苏氨酸的分泌量则显著增加，同时赖氨酸的产量则下降了原来的四分之一。,如果以该苏氨酸生产菌株作为出发株，也同样可采用类似的策略将解除调节的苏氨酸脱水酶和乙酰羟酸合成酶(从苏氨酸到异亮氨酸的合成途径的第一和第二个酶)引入异亮氨酸的合成途径。,以前，此类研究的主要目标就是鉴别被认为必须改变或绕过的

35、所谓的“瓶颈反应”。对于第一步反应受到反馈调节的某些合成途径，这一方法的确有效。并且，这一方法是运用代谢撷颃物(如合成途径的终端产物氨基酸的结构类似物)成功地实现育种策略的基础。这些代谢撷颃物的抗性突变株的突变，常常是发生在一个反馈调节的主要反应步骤(一般被叫做“代谢瓶颈”)所对应的基因上。,最典型的例子当属针对谷氨酸棒杆菌赖氨酸生物合成途径中的天门冬氨酸激酶的工作。赖氨酸生产菌种一般是赖氨酸的结构类似物AEC(aminoethyl cystein)的抗性突变株。,然而分子水平的实验证实，即便是在这种情况下，这种简单的方法仍不能导致赖氨酸的高效合成。显然，通过随机诱变和筛选所得到的高产菌株，其

36、代谢网络已发生了许多改变。从很多例子都可推断，单单改变某一“重要的”步骤(“瓶颈”)并不一定能实现氨基酸的过量合成。,因为对于长而复杂的代谢途径而言，绝对的单个限速步骤几乎是不存在的。换言之，整条途径在代谢网络范围内已经是调整好了的，“分摊式的代谢调控”(整条途径上的代谢调控实际上是由许多个步骤共同分担)的发现也说明了这个问题。这对于有目的的代谢设计是有重要意义的。,仅仅提高合成途径的流量往往并不足以将代谢流导向特定氨基酸，实现特定氨基酸的过量合成。为了增加氨基酸的生产，增加关键前体物的供应量也是十分重要的。,关键前体物的供应 可通过中间代谢的反应(如TCA环的回补反应支持 TCA 环中间产物

37、的供应、EMP途径和HMP途径分别为芳香族氨基酸的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖)，或者在培养基中额外添加特定前体物供微生物细胞吸收和利用。,当对合成途径进行修饰或导向时，中心代谢途径的反应出乎意料地成了限制因素；这一点再次强调了细胞代谢通常已得到有效的调节，这也就意味着许多不同反应之间的最佳平衡和秩序井然的分摊式控制覆盖了代谢网络的大部分。只有当合理延伸的代谢网络片段以一种协调的方式得到有目的的改变时，代谢流大规模的导向才能最终导致最优的结果。,总体来说，副产物的形成可以通过两种策略来避免：,最有利的方法是充分地调动所研究的途径，这样就不会形成大量通往副产物的中间产物了；另一种方法

38、是使从目的氨基酸的合成途径分出通往副产物合成的分支的第一个酶失活。前文所述的在生产色氨酸的大肠杆菌菌株中，去除色氨酸酶，就是这一策略的一个成功应用；这样就堵死了色氨酸过量合成条件下色氨酸的主要消耗。,当引入新的途径或者改变已建立的代谢途径上代谢流的流向时，除了要考虑碳架流，还考虑氧化还原平衡和代谢能平衡。,对氨基酸产生菌的代谢途径的大规模导向会出现一些问题。实际上，一般氨基酸的分泌，特别是谷氨酸棒杆菌中谷氨酸的分泌被解释为氧化还原作用失去平衡的结果，谷氨酸的分泌在供氧条件的试验过程中，观察到一个明显最佳状态。,在谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸或谷氨酸的条件下，不仅碳架流会发生较大的变化，糖酵解途径(产

39、生NADH)和磷酸戊糖途径(产生 NADPH)间的流量分配也必定会发生巨大的变化。,此外，从理论上推测谷氨酸棒杆菌赖氨酸最大产量的获得在很大程度上依赖于细胞的 NADPH 的水平。然而，曾尝试过确定赖氨酸生产条件下NADPH的真实化学计量，并尝试将其同其他合成反应进行比较，结果惊奇地发现 NADPH 是大大过量的，这一点至今还无法解释。,这些结果再次强调还原力定量分析的重要性，其对于氨基酸生产菌株总体流量的进一步优化，也具有潜在的重要性。,关于代谢能平衡的量化问题，就目前而言，几乎还是空白。在氨基酸生产方面，因为关于还原力平衡的问题已有一些讨论，能量平衡问题就常常被忽略。,除了ATP的形成过程

40、和已知的ATP消耗过程之间的不平衡，氨基酸过量合成显然远非仅仅与能量的输入和输出的“偶联”或“赢利”。如上所述，代谢能的重大消耗一般都能观察到，这种损耗一方面甚至会限制产物对基质的转化率，另一方面也可能是增加特定产物分泌的基础。,氨基酸的过量生产可由两种不同的代谢状态引起。诸如赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸及芳香族氨基酸等可通过解除合成途径的调节来实现过量分泌；而谷氨酸的分泌在许多细菌中则是对环境压力的响应。因此，如上所述，这两种情况下的研究策略也是不同的。,要改善氨基酸的生产，除了碳架流方面以外，在还原力控制和能量代谢方面还有很多工作等待着我们去做。,目前的研究越来越多地把兴趣放在跨膜输送反应上，

41、包括对可能限制氨基酸生产的营养因子的吸收，以及作为工艺控制中重要一步的终端产物的分泌。,氨基酸分泌系统的存在，以及其生理重要性，直到最近才得到阐明。这为氨基酸生产菌株的改良开创了一块全新的领域。这一研究方向可纳入目前的研究热点，也就是对各种反应进行流量分析，包括底物吸收、中心代谢途径、合成途径，以及产物输出。,在这些分析中，我们将实现概念上的转变，也就是从描述性数据例如细胞抽提物中有关酶的活力或底物、产物和副产物浓度的测定到稳态流量数据的分析和动力学性质的描绘的转变。这就意味着要研究流量的分布、指定的网络、被微调的酶在代谢网络中活性的微妙的变化。,为了了解原始生理背景下的代谢反应，以及在正常条

42、件下这些反应对细胞的重要性，还要求实现另一个转变，也就是由对微生物细胞输入和输出的平衡数据的测定和采集（测定细胞外培养基中的浓度），转变为获取胞内的定量信息。,当然，这同时也意味着需要有新的分析方法。胞外和胞内代谢物浓度的区别应该是可靠的，这需要靠有效的终止步骤来实现胞内外组分快速和定量的分离、也需要灵敏的分析方法来测定尽可能多的胞内代谢物。,目前研究的另一方面是，将大肠杆菌和酿酒酵母中已经非常成熟的分子生物学工具，应用到工业微生物尤其是格兰氏阳性菌中，如谷氨酸棒杆菌。遗传的成功改造通常会受到异种DNA引起的重排和丢失的限制，以及细胞的有效的制约系统的限制。,近年谷氨酸棒杆菌基因工程的一些主要工具已经构建。前几年开始研究一种可靠的转座子诱变，这种重要的工具在谷氨酸棒杆菌中仍未建立起来。,传统的菌种改良方法同现代“代谢设计”方法相比较，在许多方面仍具有竞争力。但随着我们对代谢及分子遗传学工具等方面认识的加深，有目的的代谢设计必然成为菌种改良的主要方法。在详细地了解细胞的代谢网络及代谢调控的基础上，代谢途径的构建和代谢流的导向都将成为现实。,从以下三个方面分析：1.麦汁成分；2.菌种；3.生产工艺。,啤酒酵母酿造啤酒的代谢亚网络,与其愁，不如做。做中学，学中做。勤总结，常修正。心要平，步要稳。目标明，事必成。,