资料二分子生物学工具酶.ppt

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1、分子生物学工具酶,工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切割、修饰、扩增,核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。,概 述,分类：限制性内切酶 连接酶 逆转录酶 DNA、RNA聚合酶 其它酶类,大多数来自不同的微生物和噬菌体 少数酶来自动物和动物病毒 另一些工具酶编码的基因也被克隆出来,并用大肠杆菌细胞来生产这些工具酶。,一、限制性内切酶,5-GA A T T C-3 3-C T T A AG-5,EcoRI,市场容量：1.5亿美金,其命名以该酶来源的原核生物的名称为依据。第一个大写字母：取自于属名的第一个字母 第二、三个小写字母：取自于种名的前两个字母 字母后面罗马字：该

2、种生物中不同限制酶分离先后顺序限制酶名称的前三个字母常用斜体或加下横线表示,限制酶的命名,分离纯化：几千种限制性内切酶 商品化：200多种限制性内切酶,限制酶的种类,限制性内切酶,限制性内切酶说明书,Fermentas公司,30多年研发生产历史，提供200多种高质量的工具酶通过ISO9002国际质量体系认证 精湛的实验室研发技术和实力 具有全球第二大的产限制酶的菌株(2500株)库 REBASE 中30%限制酶经过Fermentas的鉴定 30%II型限制修饰相关基因在Fermentas得到克隆 全球率先合成了“人造”酶(Eco57MI,N.Bpu10I)生产中执行最高级别的生产标准（LO T

3、est）致力于通过提高生产效率从而提升产品质量和价格竞争力全球限制性内切酶(REs)生产的领先企业市场份额：20左右，个别国家超过30的市场占有率,执行最严格生产标准 PureExtreme,自 1996 年以来，只有Fermentas始终执行分子生物学产品生产中最严格的纯度标准“标记寡核苷酸测试”（the Labeled Oligonucleotide test，”LO”test）独有的“标记寡核苷酸测试”确保 Fermentas 产品达到 PureExtreme级别在限制酶、dNTPs、DNA/RNA 修饰酶等的生产中都进行了“标记寡核苷酸测试”,传统分析方法包括：非特异性核酸酶内切分析、

4、核酸外切酶分析、连接重切分析、蓝白斑筛选分析等。但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需选择更高灵敏度的检测方法：LO Test,Labeled Oligonucleotide(LO)test,A Invitrogen B Roche C NEB D Stratagene E Promega F Fermentas,不同供应商RE LO检测分析,-,pure,contaminated,minor contamination,X,*,通过LO检测的REs(%),Roche,Invitrogen,NEB,Stratagene,Promega,Fermentas,PureExtreme 限

5、制性内切酶优势,所有Fermentas内切酶都达到 PureExtreme（致纯）最高品质保证产品投诉少严格的批间一致性 保证产品质量稳定性 几乎所以的酶都采用标准浓度 10 units/l实时质量监督,所有Fermentas RE在优化Buffer中有100%活性,Easy-to-use Five Buffer Plus System,每个Fermentas RE含两种buffer：-颜色区分，优化buffer：blue(B+)green(G+)orange(O+)red(R+)yellow(Y+/Tango)和-Universal Y+/Tango Double Digest buffer

6、,浓度优化的BSA预先加入所有RE缓冲液中,改进的 REsearch engine,DoubleDigestion，双酶切,DoubleDigest 提供DD最佳反应条件,Fermentas RE畅销排行榜（Top 20）,BamHI BcuI(SpeI)BglII EcoRI Eco47III Eco57I HindIII MboI MnlI NotI,NcoI NdeI NheI PaeI(SphI)SacI SalI TaiI(MaeII)Tru1I(MseI)XbaI XhoI,补充：PstI,与竞争对手的比较,Fermentas vs NEB,与竞争对手的比较,Fermentas v

7、s Takara,与竞争对手的比较,LO 测试 达到PureExtreme:无其它活性的污染内切酶种类第二多ISO9002 认证和质量控制 列出有效期,通过实时监控保证100活性Five Buffer Plus System，加有 BSAY+/Tango，通用双酶切buffer专注于内切酶方面价格优势,未经 LO测试内切酶种类少有认证11种 buffers及 Multi-Core 4,不提供BSA未提供双酶切的详细信息非主要产品线大幅度折扣,Fermentas vs Promega,与竞争对手的比较,LO 测试 达到PureExtreme:无其它活性的污染内切酶种类第二多ISO9002 认证和

8、质量控制 Five Buffer Plus System，加有 BSAY+/Tango，通用双酶切buffer价格优势,未经 LO测试有认证非主要产品线9种 buffers,不提供BSA 未提供双酶切的详细信息大幅度折扣,Fermentas vs Invitrogen,FastDigest Restriction Enzymes,NEW!,FastDigest 限制性内切酶,FastDigest,5min digestion,1l of enzyme,37oC temperature,ONE buffer,For ALL FastDigest enzymes,超过70多种FastDigest酶

9、数量快速增长,产品特点独特的产品线酶切质粒DNA只需5 min at 37C特殊的形式：1l enzyme 无需换算酶切单位通用Buffer，针对所有的酶切实验 一种温度：37C反应200ng 纯化的质粒DNA(5 min酶切)适合单酶切、双酶切和三酶切反应操作简单：无需考虑酶量、Buffer、温度和星活性,客户定位,基因的体外突变等诸方面,限制性内切酶的应用,各种DNA分子的体外重组,限制酶谱的绘制,基因的亚克隆分析,基因和染色体结构的分析,限制性内切酶使用常见问题分析（一）,Q1、DNA完全没有被内切酶切割内切酶失活：标准底物检测酶活性DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：

10、将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与DAN混匀进行切割验证DNA不存在该酶识别顺序：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证,限制性内切酶使用常见问题分析（二）,Q2、DNA切割不完全内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化内切酶稀

11、释不正确：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶DNA不纯，反应条件不佳：同上内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰：同上部分DNA溶液粘在管壁上：反应前离心数秒内切酶溶液粘度大，取样不准：将内切酶稀释，增大取样体积酶切后DNA粘末端退火：电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡过度稀释使酶活性降低：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏反应条件不适：使用最佳反应体系识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序：加大酶量5-10倍,限制性内切酶使用常见问题分析（三）,Q3、内切酶保存期内快速失活保存温度

12、不当：贮藏在含50%甘油的贮藏液中，-20低温保存以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存,Q4、酶切后的DNA片段连接效率低含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐内切酶失活不全或含有ATP酶：内切酶失活不全或含有ATP酶 平末端连接：加大T4 DNA Ligase用量外切酶污染：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA连接缓冲液不合适：重新配制连接缓冲液,限制性内切酶使用常见问题分析（四）,Q6、电泳后DNA片段的带型弥散，不均一DNA上结合有蛋白质：电泳前上样液65加热5min，并加

13、入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化内切酶中含有DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,Q5、DNA片段数目多于理伦值内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量其它内切酶污染：用DNA作底物检查酶切结果底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，纯化DNA片段,Q7、酶切后没有观察到DNA片段的存在DNA定量错误（如RNA含量较高）：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量在酶切反应液中形成非特异的沉淀：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次,DNA/RNA 修饰酶,

14、T4 DNA Ligase(LO tested)Klenow fragmentT4 Polynucleotide KinaseT4 DNA PolymeraseRevertAid M-MuLV Reverse transcriptases(LO tested)Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(LO tested)Ribonuclease InhibitorRibonucleasesCalf Intestine Alkaline PhosphataseShrimp Alkaline PhosphataseProteinase K,Fermentas畅销修

15、饰酶,T4 DNA Ligase LO tested,单位：Fermentas 国际Weiss unit(ATP-PP exchange)NEB 粘端连接单位1 Weiss单位 200粘端连接单位 相关产品：Rapid DNA Ligation Kit Rapid DNA Ligation&Transformation Kit,Reverse transcriptases,AMV：从禽类成骨髓细胞瘤病毒中分离，有RNase H活性，42时比M-MuLV稳定，最高逆转录温度高达72度（Finnzymes）。增加逆转录的特异性，适合具有二级结构的模板RT RevertAid M-MuLV(LO T

16、est)：从莫洛尼鼠白血病毒中分离，有RNase H活性。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA。M-MuLV(RNase H-)(LO Test)：从莫洛尼鼠白血病毒中分离，消除了RNase H活性，适合合成全长的cDNA。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA，产量比含有RNase H活性的酶要高很多。,Ribonuclease Inhibitors（RNA酶抑制剂）,概述非共价1:1结合RNase，抑制RNases-A,B,C活性。对Bacterial RNases H,T1,1,S1,U1,U2,CL3无效LO Test：超纯，无其它酶蛋白污染作用温度范围：25-55度，最佳反

17、应稳定37度,应用：RNA分离与纯化体外转录，保证RNA转录本的完整性cDNA合成：保护模板RNA、增加cDNA产率、增加全长cDNA比例RT-PCR：保护模板RNA，增加RT-PCR产率,碱性磷酸酶（AP),应用:除去载体和插入片段5-磷酸基团，预防载体或插入片段自连采用T4多聚核苷激酶标记DNA/RNA末端前，除去5-磷酸基团PCR产物测序前降解产物中的dNTPs蛋白去磷酸化,功能描述：水解ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、核糖核苷和脱氧核糖核苷，释放磷酸基团,种类:大肠杆菌碱性磷酸酶（BAP)小牛肠碱性磷酸酶（CIAP)虾碱性磷酸酶（SAP）,Ribonucleases（核

18、糖核酸酶）,除去DNA中的RNA 种类RNase A 特异性水解RNA中C和U碱基 RNase T1-特异性水解RNA中G碱基 RNase A/T1 Mix-RNase A和RNase T1混合物RNase I NEW!序列非特异性，优先水解ssRNA,应用：除去DNA溶液中的RNA，单核苷酸或寡核苷酸RNase保护分析：RNA定位分析 印迹分析,DNaseI,RNase free,识别并切割ssDNA和dsDNA，产生单核苷酸和寡核苷酸应用：制备 DNA-free的RNA，用于RT-PCR除去RNA转录系统中的DNA模板：DNA缺口翻译 DNaseI 印迹法 产生随机DNA文库,单链特异性3-5核酸外切酶，分解ssDNA 3-OH末端产生5-单核苷酸。对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA和RNA，80度加热15分钟失活。,Exo I,E.coli,