角蛋白结构功能与角蛋白遗传病.ppt
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1、角蛋白结构功能与角蛋白遗传病,西安交通大学第二附属医院皮肤科肖生祥 冯义国 任小蓉 李建国刘艳李小莉 彭振辉谭升顺 冯捷 王俊民,2,角蛋白结构与功能 角蛋白遗传病基因突变和临床系列研究,3,角蛋白简介,角蛋白是上皮细胞的主要结构蛋白,构成细胞骨架中间丝(微丝、微管、中间丝),4,角蛋白 目前已知49种,34种细胞角蛋白,15种毛 发角蛋白,型或酸性角蛋白(细胞角蛋白K9-10,K12-20,K23;毛细胞角蛋白Ha)Ha1-8,共25种型或碱性角蛋白(细胞角蛋白K1-K8;毛细胞角蛋白Hb)Hb1-6,共24种,研究背景,6,K1,K10 角化上皮的基底上层 BCIE/EH,DNEPPKK2
2、e 角化上皮基底上层的终末分化细胞IBSK2p 硬腭特异性角蛋白 未发现K3,K12角膜特异性角蛋白 MCDK4,K13非角化的复层鳞状上皮 如食道 WSNK5,K14表皮基底角质形成细胞,复层上皮 EBSK6a,K6c-f,K16掌跖,粘膜,伤口愈合时,表皮附属器 PC-1 K8,K18 单层上皮 如肝,肾 隐匿性肝硬化K9掌跖表皮 EPPKK15基底角质形成细胞 未发现K17,K6b表皮附属器,甲床,掌跖 PC-2K19单层上皮,表皮附属器 未发现K20胃肠道上皮 未发现hHb6,hHb1皮质毛细胞 念珠状发,角蛋白 主要表达组织 疾病,研究背景,角蛋白的结构,I型:II型:L1、L2、L
3、12 连接区(Linker domains)1A、1B、2A、2B 螺旋区(Helical domains)V1、V2 可变区(Variable domains)H1、H2 同源区(Homology regions)ISIS ISIS基元(ISIS motif)S 反向螺旋序列(Stutter sequence)HIP/HTP,2A,研究背景,角蛋白基因结构,I型:II型:,9,10,11,12,角蛋白不同结构区氨基酸数统计,13,角蛋白序列的保守性 1.不同个体之间的保守性:1A起始部和2B末端 15-20aa 2.不同角蛋白之间的保守性 螺旋起始区:I型 1A区第7个aa始 LNDRLAS
4、Y II型 LNNKFASY 螺旋终止区:EIATYRKLLEGE(如K1 2B末端倒数第5个氨基酸),14,角蛋白功能,参与上皮细胞角化、分化;机械性支持维持细胞形态;细胞内物质运输、信息传递,15,角蛋白基因敲除小鼠的表型,16,角蛋白与疾病,角蛋白 疾 病K1、K10 大疱性鱼鳞病样红皮病K5、K14 单纯型大疱性表皮松解症K6、K16、K17 先天性厚甲K8、K18 隐匿性肝硬化K9 表皮松解性掌跖角化症hHb6、hHb1 念珠状发K7、K15、K19、K20 不清楚,讨论,讨论,角蛋白中间丝的装配,19,角蛋白遗传病基因突变和临床系列研究,20,技术路线和实验方案,患者家系基因突变分
5、析 收集患者家系临床资料、病理标本、采集外周血 提取外周血基因组DNA PCR扩增外显子 DNA序列分析 患者正常人同源性分析 确定基因突变位点 排除多态性,21,先天性厚甲症(Pachyonychia congenita,PC)是一组常染色体显性遗传病,特点是甲营养不良和不同程度的外胚叶发育不良。,22,根据临床表现主要分为两型,PC-1表现为厚甲伴有局灶性掌跖角化、口腔粘膜白斑等。PC-2除具有PC-1的特征外还伴有胎生牙和多发性脂囊瘤。多发性脂囊瘤是PC-2最好的鉴别特征。,23,PC患者的厚甲通常是在出生后头几个月出现。一些PC患者甲改变发生较晚,称为迟发性先天性厚甲。多发性脂囊瘤通常
6、在青春期发生。研究发现,PC-1由于角蛋白K16、K6a基因突变所致,PC-2由于角蛋白K17、K6b基因突变所致。,24,先证者及其子的厚甲,25,先证者头部多发性脂囊瘤,26,先证者及其子的多发性脂囊瘤,27,先证者及其子的局灶性掌跖角化,28,29,30,研 究 方 法,31,1.血样采集 采集家系成员(包括9例患者、1例正常人)外周血35ml,2EDTA抗凝,-70冷冻保存。另外抽取正常对照50人份外周血做同样处理。,32,2.外周血基因组DNA提取 用全血基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA。,33,3.聚合酶链反应(PCR),选择并合成引物:引物合成参照Mclean WH等在Na
7、ture Genetics 上的文献。上游引物K17p8和下游引物K17p10。这对引物可使角蛋白K17基因外显子1及其侧翼序列得到选择性扩增,扩增出978bp的DNA片段,并且避免了扩增两个假基因K17B和K17C。,34,K17P8和K17P10扩增的DNA片段稀释1:10000倍作为巢式PCR模板。巢式PCR的上游引物序列为:5-GCTGCTACAGCTTTGGCTCT-3;下游引物序列为5-CACGACGTTGTAAA ACGACCAGTCACGGATCTTCACC-3。,35,PCR反应:总体积为50l,反应液成分包括5l缓冲液,10mmol/L dNTP 1l,25mol/L上、下
8、游引物各1l,Taq酶0.5l(2.5U),25 mmol/L MgCl2 5l,模板10l。反应条件:,36,4.基因测序 PCR产物采用全自动DNA测序仪进行序列测定,测序结果进行同源性分析。,37,结 果,38,1.DNA提取结果 外周血全基因组DNA提取后电泳,可见其大小约为23kb(Marker为DNA Hind)。,39,2.PCR反应结果PCR反应产物电泳,扩增出大小为978 bp的DNA片段(Marker 为DGL2000)。,40,patient,normal,41,3 DNA测序结果,患者,患者,正常人,正常人,42,讨 论,43,体外实验表明,1A区起始部的突变对角蛋白装
9、配影响较大,而1A区后半部的突变对角蛋白装配影响较小。临床上发现的角蛋白突变位于1A区后半部的较少。,44,角蛋白17模式图及我们发现的突变位置,45,我们发现的突变为角蛋白K17的N109D突变,为一新的错义突变。因此,在进行中国人PC-型基因诊断或产前诊断时,除了参考国际上已报道的突变位点外,应注意这一新的突变位点的可能性。,46,我们报道的这一PC-家系,厚甲均为迟发(10至20岁发生),基因突变位于K17 1A区的后半部,为一新的突变N109D。,47,结合Connors等和我们的研究结果,K16 2B区中间部和K17 1A 区后半部的基因突变可以呈现为迟发型厚甲。我们的研究结果表明角
10、蛋白的突变位置与疾病的发生年龄有关。发生在角蛋白非关键部位的突变引起疾病迟发。,48,通过2个家系初步的研究表明,中国PC-2型患者基因突变与其他种族相比,有相同之处,又有不同之处。本研究为进行中国人PC-2型基因诊断及产前诊断奠定了基础。,49,单纯型大疱性表皮松解症的基因突变及临床研究 Investigation on Gene Mutations and Clinical Phenotypes of Epidermolysis Bullosa Simplex,结果,1.临床资料,家系一 先证者,女,30岁。自述自幼年起至今,四肢末端,特别是手足部位受摩擦后出现黄豆至核桃大小水疱、大疱;在
11、春夏季节发作较频繁。家庭情况:先证者的女儿及母亲生前有相同症状;父亲、哥哥正常,未曾出现过类似皮损。,结果,双足摩擦部位可见水疱、大疱,结果,双足跖可见大疱及灶状角化过度,结果,家系谱图,结果,散发病例一,患者,男,11岁。在出生后3天,双足出现蚕豆至鸽卵大小的大疱,自行愈合,未留瘢痕;约在生后3、4月时,手足、四肢陆续出现水疱、大疱,躯干部位亦出现水疱,但主要集中在四肢远端部位。就诊时在四肢远端可见散在的水疱、大疱以及水疱干涸后的结痂;家庭情况:父母正常,妹妹正常。,结果,双手掌、腕部可见水疱、大疱,结果,2.HE染色结果,水疱及裂隙看似位于表皮下,结果,3.PAS染色观察,阳性反应的基底膜
12、位于裂隙的底部,提示水疱位于表皮内。,结果,皮损附近基底层细胞可见有空泡,提示水疱裂隙位于表皮内。,结果,4.透射电镜观察,D.真皮,E.表皮,BM.基底膜,水疱裂隙。,结果,双足跖可见灶状角化过度,结果,散发病例二,患者,男,39岁,自述自幼年至约18岁期间,手足、小腿等部位频繁出现水疱,自行愈合后不留瘢痕;在春夏季节发病较频繁;成年后,发作次数明显减少。双足跖、趾腹承重部位灶性至弥漫性角化过度。指(趾)甲轻度至中度营养不良。家庭情况:其一子一女正常,父母生前无类似症状。,结果,双足跖、趾腹部可见灶状至弥漫性角化过度。,结果,指(趾)甲营养不良,结果,散发病例一和散发病例二系谱关系见下图,结
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- 角蛋白 结构 功能 遗传病

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