血液病基因检测的临床意义.ppt

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1、髓细胞系恶性肿瘤,根据细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学以及临床特征WHO分型法将髓系肿瘤分为 骨髓增生性疾病（MPD）（肿瘤，MPN）骨髓增生异常/骨髓增生性疾病（肿瘤）（MDS/MPD,MDS/MPN）骨髓增生异常综合征（MDS）急性髓细胞白血病（AML）四 大 类,PH染色体t(9;22)(q34;q11),BCR/ABL阳性 的慢性髓系白血病（CML）慢性中性粒细胞白血病（CNL）慢性嗜酸粒细胞白血病/高嗜酸粒细胞综征（CEL/HES）真性红细胞增多症（PV）慢性原发性骨髓纤维化（伴髓外造血）（CIMF）原发性血小板增多症（ET）不能分类骨髓增生性疾病 七 类,骨髓增生性肿瘤（

2、MPN）,骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤（MDS/MPN）,是一种克隆性造血干细胞疾病，特点表现为MDS与MPD交叠，有多种“有效”造血及病态造血存在。慢性粒-单核细胞白血病（CMML）不典型慢性髓系白血病（aCML）幼年型粒-单核细胞白血病（JMML）不能分类的MDS/MPD 四 类,骨髓增生异常综合征（MDS）,MDS也是克隆性疾病，以无效造血为其特征引起血细胞减少，骨髓及血象一至多系细胞病态造血。,MDS亚型分类 亚型 外周血象 骨髓象 1.难治性贫血 贫血；未见或罕见 仅红系增生异常，（RA）原始细胞 原始细胞 5%，环形铁粒幼细胞15%2.难治性贫血伴贫血；未见或罕见 仅红系增生异常，

3、环形铁粒幼细胞原始细胞 原始细胞 5%，（）环形铁粒幼细胞15%3.难治性血细胞减少 血细胞减少（二系或 二系或多系细胞增生异常 伴多系增生异常 全系）；未见Auer小体；10%；原始细胞 5%，（RCMD）未见或罕见 原始细胞；未见Auer小体；单核细胞1109/L 环形铁粒幼细胞15%4.难治性血细胞减少 血细胞减少（二系或 二系或多系细胞增生异常伴多系增生异常和 全系）；未见Auer小体；10%；原始细胞 5%，环形铁粒幼细胞 单核细胞1109/L 未见Auer小体；（RCMD-RS）环形铁粒幼细胞15%,亚型 外周血象 骨髓象5.难治性贫血伴 血细胞减少，一系或多系细胞增生异常；原始细

4、胞增多1型 原始细胞5%原始细胞5%9%；（RAEB-1）未见Auer小体；未见Auer小体；单核细胞1109/L6.难治性贫血伴 血细胞减少，一系或多系细胞增生异常；原始细胞增多2型 原始细胞5%19%原始细胞10%19%；（RAEB-2）Auer小体（）；Auer小体（）；单核细胞1109/L7.未归类的MDS 血细胞减少，单一髓系细胞增生异常；（MDS-U）未见或罕见原始细胞；原始细胞5%；未见Auer小体；未见Auer小体；8.5q-综合征 贫血；少叶核巨核细胞正常或增多；del（5q）血小板计数正常或增高；原始细胞5%；原始细胞5%；细胞遗传学检测仅见 del（5q）异常；未见Aue

5、r小体；,AML是髓系原始细胞克隆性增生疾病，WHO分型将AML分为：1.伴有特殊染色体的AML 2.伴有病态造血的AML 3.治疗相关的AML和MDS 4.不伴特殊细胞遗传易位的AML 四亚型。,急性髓细胞白血病（AML）,1伴有特殊细胞遗传易位的AML（1）伴有t(8;21)(q22;q22)AML,AML1（CBF）/ETO的AML（2）伴有inv(16)(p13;q22)或 t(16;16)(p13;q22),CBF/MYH11的骨髓嗜酸粒细胞增多的AML（3）伴有t(15;17)(q22;q11-12),PML/RAR 及变异的急性早幼粒细胞白血病（APL）（4）伴有11q23(ML

6、L)异常增生的AML,2伴有多系血细胞增生异常的 急性髓细胞白血病（1）由MDS或MDS/MPD转化而成（2）发病前无MDS病史,3治疗相关的AML和MDS（1）与烷化剂相关（2）与拓扑异构酶抑制剂相关（一些可以是淋巴系）（3）其他,4不伴特殊细胞遗传易位的AML（1）未分化AML（2）未成熟AML（3）成熟AML（4）急性粒-单核细胞白血病（5）急性单核细胞白血病（6）急性红白血病（7）急性巨核细胞白血病（8）急性嗜碱细胞白血病（9）伴骨髓纤维化的急性全髓增生（10）髓细胞肉瘤,淋系肿瘤：B系肿瘤和T/NK细胞系肿瘤 又可分为两大类型：前体淋巴细胞肿瘤（淋系白血病）外周或成熟淋巴细胞肿瘤（淋

7、巴瘤）前者指淋巴细胞分化的早期阶段起源的肿瘤 后者是分化成熟阶段来源的肿瘤,B细胞系肿瘤 前体B细胞肿瘤 前体B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤（B-ALL/LBL）成熟（周围）B细胞肿瘤 B-慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（B-CLL/SLL）B-细胞幼淋巴性细胞白血病（B-PLL）淋巴浆细胞淋巴瘤（LPL）Burkitt淋巴瘤（BL）多毛细胞白血病（HCL）浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤（PCM/PCL）脾边缘区B细胞淋巴瘤，绒毛状淋巴细胞（SMZL）结外边缘区B细胞淋巴瘤，MALT型（MALT-MZL）结型边缘区B细胞淋巴瘤，单核细胞样B细胞（MZL）滤泡性淋巴瘤（FL）套细胞淋巴瘤（MCL）弥

8、漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）,T细胞和NK细胞系肿瘤前体T细胞肿瘤 前体T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病（T-LBL/ALL）成熟（周围）T细胞肿瘤 T-细胞幼淋巴细胞白血病（T-PLL）T-大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGL）侵袭性NK细胞白血病（ANKCL）成人T细胞淋巴瘤/白血病（ATCL/L）结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）肠病型T细胞/淋巴瘤（ITCL）肝脾T细胞淋巴瘤 皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤 蕈样真菌病/Sezary综合征（MF/SS）间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）,霍奇金淋巴瘤（霍奇金病）结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤（NLPHL）经典型霍奇金淋巴瘤 结节硬化型霍奇金

9、淋巴瘤，1和2级（NSHL）富于淋巴细胞经典霍奇金淋巴瘤 混合细胞型霍奇金淋巴瘤（MCHL）淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤（LDHL）,白 血 病 基 因 检 测,基因突变是指由于DNA分子中发生碱基对的_而引起的_的改变。,增添,替换,缺失,（D）,（d1）,（d2）,（d3）,增添、缺失或替换,基因结构,基因突变一定会导致生物性状的改变吗?,mRNA:,G A A,甲 乙 丙 丁,DNA碱基对替换，不一定引起蛋白质结构的改变。,结论:,碱基对替换一定会导致蛋白质结构的改变吗?,氨基酸:,天冬氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,缬氨酸,G A U,G A C,G U A,1、二战时，美国在日本的广岛、长崎投

10、下两颗原子弹，导致白血病患者出生率增加。,2、苏丹红进入人体可产生致癌作用。,3、乙肝病毒使肝细胞进一步变异，肝细胞不凋亡，而且不断地再生，就形成了肝癌。,内因：DNA复制时自身也偶尔发生错误,物理因素,化学因素,生物因素,基因突变原因：,基因突变的特点,大多数基因突变对生物体是有害的，只有少数是有利的，有些既无害也无益。,多数有害,结果：增殖过度，分化阻断，凋亡受抑,白血病的分子检测,Southern blotNorthern blotWestern blotFISHPCR测序芯片,白血病的分子检测,PCR方法优点 快速 灵敏 特异PCR方法缺点 假阳性 假阴性,！,白血病的分子检测,PCR

11、：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。RQ-PCR：可定量扩增产物。,白血病分子检测的临床应用,白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：补充MIC检查的不足 发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（MRD）为研究白血病的发病机制打下基础,白血病分子检测的临床应用,PCR方法检测MRD常用的分子标志,AML1-ETO,t(8;21)(q22;q22)68%原发性AML，在M2中的阳性率为2040%，在M2b中阳

12、性率为90%少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他AML亚型（M3除外）好,AML1-ETO,对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况 RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水平。连续定量AML1-ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发

13、,PML-RAR,t(15;17)(q22;q21)，98%M3患者阳性继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RAR的变异性染色体易位：t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)，dup(17)(q21.3;q23)，t(11;17)(q23;q21)分别产生NPM-RAR，NuMA-RAR和PLZF-RAR，STAT5b-RAR融合基因临床上，具有PLZF-RAR或STAT5b-RAR融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解,PML-RAR,APL累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意图,PML-RAR,由于PM

14、L基因断裂点不同，产生3种不同的PML-RAR异构体 约55%的M3患者为L型，40%为S型，5%为V型，且每位患者只表达一种PML-RAR融合蛋白形态学上S型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低,PML-RAR,RT-PCR检测PML-RAR是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监测。PML-RAR阳性提示的分子复发常早于临床复发3-6个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值,FLT3基因突变

15、,Fms-related tyrosine kinase 3FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和c-KIT）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用据报道，FLT3-ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核型之外,CBF-MYH11,inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)主要见于

16、M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2CBF-MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子（core binding factor,CBF）的转录激活作用而致病 具有CBF-MYH11的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义,CBF-MYH11,CBF-MYH11具有多种变异型，其中最常见的为A型，占80%RT-PCR检测CBF-MYH11进行MRD监测显示，大部分患者在完全缓解时PCR转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍为阳性最新研究采用RQ-PCR检测CBF-MYH11转录本水平来评价M4Eo患者MRD情况，预示复发,DEK-CAN,t(6;9)(p23;q34)主要见于M

17、2或M4，也见于M1，MDS-RAEB伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较差此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案,WT-1基因高表达,Wilms tumor 1是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关,BCR-ABL,t(9;22)(q34;q11)1530%成人ALL及35%儿童ALL 9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色体断裂点具有异质性 此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点BCR-ABL+ALL患者预后差，5年

18、存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗,BCR-ABL,对于自体或异体移植ALL患者，移植前后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录本类型与预后有关,E2A-PBX1,t(1;19)(q23;p13)56%儿童ALL和3%成人ALL 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实,TEL-AML1,t(12;21)(p13;q22)25%儿童A

19、LL，是儿童ALL中最常见的分子异常 目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（2%）此类患者发病年龄小（2岁10岁），WBC计数低（50 000/L），免疫表型为前B-ALL此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好,TEL-AML1,由于12p和21q末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%，需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳性率TEL基因重排是独立预后因素，RT-PCR检测TEL-AML1融合基因能将低危险度与高危险度的ALL患者区分开来。因此早期检测TEL-AML1融合基因对临床

20、预后，确定合适的治疗方案都有重要意义,MLL相关融合基因,累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受topoisomerase II抑制剂治疗的患者 MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因 ALL t(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因 AML t(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因 AML及ALL,MLL相关融合基因,MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有

21、双重作用：融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化 MLL发生断裂后，缺失锌指结构域的MLL不能与DNA结合，失去其转录活化功能，使受MLL调节的靶基因（HOX基因）表达异常，也影响造血细胞的发育,MLL-AF4,t(4;11)(q21;q23)t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿ALL中最多见，为5070%，而在儿童和成人中较低，分别为2%和36%此类患者发病年龄低（通常2岁），白细胞计数高，常伴有内脏巨大并累及中枢神经系统此类患者病情凶险，预后差。患者对标准治疗方案很可能无效，需给予强化治疗。目前应用高剂量Ara-C治疗，使这些患者预后有所提高,MLL-AF4,对2岁的婴幼儿急

22、性白血病患者应常规进行MLL-AF4融合基因的检测以筛选出高危患者，给予强化治疗提高生存率RT-PCR可在所有t(4;11)患者初发时检测到MLL-AF4融合基因。由于该融合基因累及的2个基因的断裂点变异性较大，因此PCR应包括所有断裂点以免产生假阴性结果,TAL1基因重排（1）,t(1;14)(p32;q11)，TAL1-TCR融合基因 3%T-ALL 易位使TAL1基因与TCR位点并置，其5端正常转录调节被TCR 5部分所取代，而后者在T细胞中有高表达,TAL1基因重排（2）,1p32缺失，SIL-TAL1融合基因 1626%T-ALL，该重组仅见于T-ALL，是T-ALL的一个有用的克隆

23、标志缺失部分可能为TAL1基因的调控序列，使TAL1基因表达失控，导致与染色体易位相似的表型常规遗传学方法检测不到这一异常，而SIL-TAL1融合处特异的序列能作为这类患者特异的分子标志用于PCR检测,TAL1基因重排（3）,TAL1异常仅见于T-ALL，尚未见于B-ALL，AML和T细胞NHL，是儿童T-ALL中最常见非随机遗传缺陷，是监测大多数T-ALL的侯选基因伴TAL1异常的患者血象表现为高白细胞计数，高血红蛋白含量，免疫表型为CD2+/CD10尽管在治疗反应上，有TAL1重排患者和无TAL1重排患者无显著差异，但伴TAL1重排患者4年无事件生存率（EFS）高于不伴TAL1重排的患者，

24、分别为5911%和447%，提示伴TAL1重排患者预后较好,HOX11基因异常表达,t(10;14)(q24;q11)，t(7;10)(q34;q24)7%的T-ALL 易位使HOX11基因受控于TCR和TCR基因调控序列，导致其异常表达另有部分HOX11高表达患者核型正常伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，预后也较其他T-ALL患者要好，完全缓解率为100%，平均无病生存期为46个月，3年无病生存率为75%,HOX11L2基因异常表达,t(5;14)(q35;q32)20%的儿童T-ALL 易位使HOX11L2基因处于CTIP2调控元件的控制下，而CTIP2基因在T淋巴细胞分化时高度表达在随

25、访患者中检测到高水平HOX11L2说明白血病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患者HOX11L2表达水平迅速降低，并维持在一个低水平。可见HOX11L2的表达水平可作为MRD检测的标志,NOTCH1基因突变,NOTCH1信号对CLP(common lymphoid progenitors)向T细胞定向以及前T细胞受体复合物组装是必须的35-50%T-ALL患者存在此基因突变伴NOTCH1基因突变的成年T-ALL患者预后较差,NOTCH1基因突变,生存曲线,BCR-ABL,t(9;22)(q34;q11)90%CML患者BCR-ABL融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激酶活性较正常ABL高，可能

26、是BCR对ABL激酶活性调节区的作用所致由于5%CML患者为隐匿性Ph染色体，因此无Ph染色体CML患者还需使用更灵敏的分子检测手段如FISH或RT-PCR检测BCR-ABL融合基因RT-PCR还能区分e1-a2和b2-a2/b3-a2二种BCR-ABL转录本，从而区分ALL患者与CML急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案,C M L,BCR-ABL,巢式RT-PCR检测BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD监测。可在患者血液学复发前的624个月骨髓检测就呈阳性。RQ-PCR还能动态观察患者治疗后BCR-ABL转录本水平变化情况，反映疗效。,GATA2基因突变,调

27、控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力CML急变患者中新发现GATA2基因突变，而CML慢性期、加速期，AML（M1-M7），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，可见GATA2基因突变仅与CML急变相关，是CML疾病进展过程中的获得性突变。总发生率为12.5%（5/40），且均造成CML急粒单变GATA2基因突变与CML患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明,JAK2基因突变,Janus kinase 2此基因突变主要见于MPD和MDS，另可存在于部分AML尤M2突变为V617F突变去除了JAK2 JH2负性调控，导致该基因

28、的持续活化，赋予细胞增殖存活优势JAK2可成为靶向治疗的靶点,MDS相关基因异常,Delta样(Dlk)基因编码Dlk蛋白在MDS明显增高者55%，而AML仅10%，可能是MDS特异性基因，但作为诊断MDS的标志基因尚待进一步确定,MDS相关基因异常,RAS此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶(GTPase)调节细胞生长相关信号ras癌基因的活化，尤其是N-ras的激活可在约35%的MDS患者中发生FMS为集落刺激因子1，控制单核-巨噬细胞生长、分化及功能fms基因的突变可在16%的MDS患者中发现ras和fms突变主要见于粒-单细胞分化的疾病，即MDS中的CMML，患者生存期短，转AML多,

29、MDS相关基因异常,p53在MDS时，p53突变较少见(5%)，但在较为进展的病例中可高达15%p53突变意味着化疗耐药和生存期缩短，因而是一种有意义的预后指标FLT310%MDS有FLT3点突变，加快进展为AML，但FLT3-ITD少见AML1(RUNX1)为MDS较常见的点突变，发生率25%，导致核心结合因子(CBF)亚单位正常功能缺失，易转化AML,Ig/TCR基因重排,Ig的基因由L，L和H三个基因组组成，分别编码L链，L链和H链。L和H基因又由编码Ig分子的V区和C区基因构成。TCR由两条肽链组成，链或链，不论是哪一种肽链，其胞膜外区均包括两部分，即V区和C区。相应的编码基因为TCR

30、A,TCRB,TCRG和TCRD。,Ig/TCR基因重排,Ig/TCR基因重排检测，对决定白血病的细胞来源系列乃至分化阶段，有重大意义在B系ALL中分别有95%，54%，55%和33%的患者有IgH，TCR，TCR和TCR基因重排，在T-ALL中相应的基因重排率分别为14%，68%，91%和89%由于重排的多样性，重排的Ig和TCR基因连结区序列在各淋巴(前体)细胞中是不同的，因而每位患者有其各自特异的Ig/TCR基因重排序列，这一特定的Ig/TCR基因重排序列可作为该恶性克隆的分子标志，在分子水平进行诊断分型，还可通过PCR检测缓解期患者有无初发时的Ig/TCR基因重排来追踪残余白血病细胞（MRD)，用于预后判断,