血型的鉴定方法及操作.ppt

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1、红细胞血型系统及其检测,重庆医科大学临床血液教研室,血型的发现,1900年，ABO血型系统1940年，Rh血型系统 Karl Landsteiner,血型（blood type),狭义地讲，存在于红细胞上的特异性同种抗原。广义地讲，是人类遗传多态性的一种表现，血液中各种成分都有其各自型别。,红细胞血型（系统，抗原）,是存在于红细胞上的化学结构，化学本质是糖和多肽，是红细胞膜上的跨膜蛋白。存在于红细胞膜上（完全抗原），也存在于上皮细胞以及各种体液和分泌液中（半抗原）。,RBC,存在于体液、分泌液中,红细胞血型抗体,天然抗体、免疫抗体规则抗体、不规则抗体完全抗体，不完全抗体同种抗体，自身抗体,天然

2、抗体和免疫抗体,天然抗体：ABO血型系统中，A型个体血浆中天然存在抗B，B型个体血浆中存在抗A。多数天然抗体是IgM型，最佳反应温度为室温或更低。免疫抗体：一般通过输血、妊娠、注射三种方式接受抗原刺激，多数免疫抗体是IgG型，最佳反应温度是37oC。,天然抗体和免疫抗体特性比较,规则抗体和不规则抗体,规则抗体：ABO系统产生抗、抗是有规律的。Landsteiner规律：型抗，型抗，型抗，抗不规则抗体：除ABO 系统外，其他系统产生的抗体均不符合上述规律。正常人血液中一般没有不规则抗体，又称为意外抗体（unexpected antibody）。,完全抗体和不完全抗体,完全抗体：在盐水介质中能凝集

3、红细胞抗体，多为IgM抗体。不完全抗体：能使红细胞致敏，但在盐水质中不能凝集红细胞，需要通过抗球蛋白法或其他非盐水介质法进行检测，多为IgG抗体。,抗IgG,同种抗体、自身抗体,同种抗体：针对患者缺乏的抗原所产生的抗体即为同种抗体，如Rh阴性者输血后产生的抗抗体。自身抗体：针对自身抗原产生的抗体，如引起自身免疫型溶血性贫血。,红细胞血型,红细胞血型分类：ISBT（The International Society of Blood Transfusion)2002年，29个系统，200多个抗原 目前，30个系统，300多个抗原,一、ABO血型系统1.ABO血型抗原和抗体特性,2.ABO血型的遗

4、传与生化,（1）ABO基因型与表型 A型AA，AO B型BB，BO AB型AB O型O A，B是显性基因，O是隐性基因 ABO基因不是产生ABO抗原的遗传密码,（2）ABO血型的生化合成,H基因 L-fucocyltransferase，19chr A基因 N-acetyl-0-galactosaminyltransferase，9chr B基因galactosyltransferase,9chrO基因无效基因，不产生转移酶，O型红细胞含有H物质,基因,酶,合成抗原,思考：A、B、AB型红细胞是否存在H物质？,（3）ABH可溶性抗原形成,分泌型血型物质：ABH抗原存在于红细胞、内皮细胞、血小板

5、、淋巴细胞、上皮细胞等，也可出现在除脑脊液外的分泌液中，唾液中最丰富。Se，se基因与体液分泌有关，Se编码 L-fucocyltransferase，形成分泌液中的H抗原，H也可转化为A或B抗原，Se不影响红细胞上ABH形成，Se为分泌型；se为非分泌型；19chr。,分泌型血型物质的意义：,在RBC抗原弱表达个体中确定ABO血型。检测唾液、羊水中的血型物质，辅助鉴定血型和预测胎儿血型。能中和天然抗体（IgM），有助鉴别Ab性质。,3.ABO亚型：,亚型：同一血型抗原的结构、性能（质）或抗原位点数（量）存在一定差异。A亚型：A1，A2，A3，Ax，Ay，AmB亚型：B1，B2，B3，Bx，B

6、m,二、Rh血型系统,1940年，Landerstein和Wiener用恒河猴（rhesus）RBC免疫家兔或豚鼠，得到一种抗体，可与85%白种人红细胞发生反应。Rh系统有50个抗原，最复杂，重要性仅次于ABO血型。,1.遗传与发育规律,胎儿早期充分发育，脐带血/新生儿红细胞同成人。基因位于1chr，分别命名为RHD，RHCE，RHD编码D抗原，RHCE编码不同组合的CE抗原，ce，cE，Ce，CE。,2.命名和种类,三种命名方式 Fisher-Race、数字命名法、现代命名法,Fisher-Race命名法（CDE命名法）,3.Rh血型种类,D、E、C、e、c抗原的强弱次序 DECce,5.R

7、h抗体,Rh抗体产生 天然抗体罕见 主要通过输血和妊娠免疫产生IgG 初次免疫后36月出现，再次免疫后3周达高峰Rh抗体种类 抗D，抗E，抗C，抗c，抗e,ABO和Rh血型系统的临床意义,安全输血的主要保证新生儿溶血病的诊断器官移植的必要条件其他：遗传学研究，法医学鉴定,四、ABO和Rh血型鉴定,常用方法：盐水介质法、酶介质法、抗人球蛋白法、聚凝胺法 试管法、玻片法、微柱凝胶法,1.盐水介质法（salt medium test）,原理：根据IgM类抗体与红细胞膜上特异性抗原能发生凝集反应。正定型：已知血型抗体试剂+红细胞 反定型：已知标准红细胞+血清,鉴定红细胞上血型抗原,鉴定血清中抗体,反应

8、条件：生理盐水介质，室温，肉眼可见凝集反应平板法，试管法，微孔板法，试管离心法最可信赖。应用：ABO血型定型、RhD抗原定型（IgG+IgM，IgM单克隆抗体），交叉合血,结果判断,注意事项（一）：,标准血清：健康壮年人混合血清，培养细胞株的单克隆抗体要求：高效价：抗A、抗B1：128 高亲和性：15s内出现凝集，3min后凝集块 1mm2 单克隆抗体具有检出A2，A2B的能力 冷凝集素效价 1：4 无菌，病毒灭活,注意事项（二）：,红细胞试剂：三个健康者同型新鲜红细胞混合，用生理盐水洗涤三次。红细胞悬液不能过浓或过淡，5%生理盐水红细胞悬液,注意事项（三）：,所有器材清洁干燥一般先加血清，后

9、加红细胞反应温度：IgM抗体反应最适温度为40C，为防止冷凝集素干扰，采用室温，370C反应减弱离心时间和速度：3000g,30s反定型不宜用玻片法结果核对，避免笔误正、反定型结果一致才能报告，否则查找原因,正反定型不一致的可能原因（一）：,操作技术上的错误：主要原因 离心过度或不足 细胞与血清反应比例不适当 阳性反应产生溶血现象而未能识别 漏加试剂、结果判读错误等,正反定型不一致的可能原因（二）：,出现假阴性的常见原因：某些白血病患者和难治性贫血等导致ABO抗原减弱；免疫系统尚未健全的新生儿、4月6月内婴儿、抗体水平下降的老人；亚型红细胞抗原性弱，难以检出；低丙种球蛋白血症患者，血清定型时不

10、凝集或弱凝集。,正反定型不一致的可能原因（三）,出现假阳性的常见原因：红细胞出现多凝集现象；严重肠道革兰氏阴性杆菌感染，可使红细胞获得类B现象；异常的血浆蛋白升高、白蛋白/球蛋白异常，高浓度纤维蛋白原造成假凝集现象；待检血清中有不规则抗体存在；右旋糖酐、静脉注射某些造影剂等引起红细胞 类似凝集。,方法学评价,简单，灵敏度低，只适合IgM抗体试管法：需时短，离心增强凝集，可发现亚型和较弱的反应，正、反定型皆适合玻片法：适合大规模血型普查，反应时间长，有时漏掉弱反应，反定型不适合。,2.酶介质法（enzymic medium test）：,原理和方法：主要用于Rh血型鉴定（IgG抗体）,蛋白水解酶

11、,增强IgG抗体的凝集作用,注意事项：,Rh血型不需作反定型每次实验均需作阳性、阴性对照,方法学评价,简单经济稳定性、准确性较差，不能检出MN、Duffy血型系统,3.抗人球蛋白实验（Coombs test）,原理和方法,抗IgG,待测红细胞+抗RhD（IgG）+抗人球蛋白,红细胞凝集,应用延伸：,检测红细胞同种抗体的经典方法，新生儿溶血、病、溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血直接Coombs（direct antiglobulin test,DAT）间接Coombs（indirect antiglobulin test,IDAT）,DAT：检查红细胞是否致敏,IDAT：检测血清中不完全抗体

12、,4.聚凝胺介质法（polybrene test）,原理和方法 低离子强度盐溶液（low ionic strength salt solution,LISS)：降低介质离子强度，增加抗原抗体结合 聚凝胺：中和红细胞表面负电荷，使红细胞发生非特异性凝集。重悬液（resuspension),方法学评价,适于各类抗体（IgM，IgG）快速、灵敏、可靠对检测Kell血型系统抗体不理想，不能用肝素抗凝。,5.微柱凝胶法(gel cards with microtubes),1986年法国人Dr.Yves Lappierre发明1994年，获美国FDA认证,原理和方法,葡聚糖做成微型凝胶柱，上端为反应室，

13、下端凝胶柱为抗原抗体凝集反应的介质。抗原与抗体结合后离心，经过凝胶分子筛作用，游离红细胞在凝胶底部，而与抗体结合凝集的红细胞位于凝胶上部或悬浮于凝胶中。,反应室,凝胶柱,结果判读：,阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中，和（或）出现溶血。,注意事项：,专用水平离心机假阳性：镰型红细胞、巨幼红细胞 白细胞过多 纤维蛋白原未完全去除 细菌污染，血浆蛋白异常假阴性：抗原抗体比例不合适不适用于直接Coombs阳性的红细胞标本、酶处理的红细胞标本,方法学评价,灵敏度和准确性高，实验结果重复性好，可长时间保存自动化程度高，实验过程标准化，ISO9000/CE认证成本高,应用延伸：用于ABO正反定型，交叉配血、其他血型抗原检测（CcEe）、不规则抗体检测、Coombs实验,凝胶柱,中性胶,抗人球蛋白胶,特异性胶,三、交叉配血（cross matching）,定义,检测意义,是安全输血的重要步骤进一步验证血型鉴定是否正确发现ABO、Rh血型以外的其他抗体,常用方法及评价,结果判断（同型输血）,主侧、次侧管均无凝集、无溶血，表示配血相容，献血者血液可以输注；出现主侧、次侧试管或单独一侧试管内红细胞凝集和（或）溶血，则表明两血不相容，献血者血液不可输注。,同型输注是输血的基本原则紧急情况下,