蛋白质的结构、功能及分离纯化.ppt

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1、第四章,蛋白质的共价结构,（一）蛋白质的化学组成和分类1、元素组成 碳 50%氢7%氧23%氮16%硫 0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮6.252、氨基酸组成蛋白质是由20种L-型氨基酸组成的长链分子,一、蛋白质通论,3、分类（1）按组成：单纯蛋白质：只含氨基酸成分；可以根据其物理性质进行分类缀合蛋白质：氨基酸+辅基（配体）；可以按其非氨基酸成分进行分类（2）按生物学功能：酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白。,（二）蛋白质分子的形状和大小,1 形状纤维状蛋白质：具有比较简单球状蛋白质膜蛋白质,2 大

2、小少于50个氨基酸的低分子量多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也称多肽。多于50个氨基酸的称为蛋白质。蛋白质分子量=氨基酸数目*110,蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。一级结构：氨基酸顺序二级结构：螺旋、折叠、转角，无规卷曲三级结构：整个肽链（亚基）的形状；四级结构：亚基之间的聚集形式。,（三）蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次,（四）蛋白质功能的多样性,催化酶，生物催化剂调节激素蛋白类，调节体内的物质代谢过程或参与基因表达的调控转运运输蛋白类，通过血流或膜通道转运特定的物质贮存能贮存氨基酸等，作为机体的营养物，在需要时提供各种元素运动使细胞或生物体发生运动结构成分具有强大的抗拉

3、作用，对机体起支持作用支架作用在细胞应答激素和生长因子的途径中起作用防御和进攻在细胞防御、保护和开发方面的主动作用异常功能,二 肽,肽(peptides)是由氨基酸通过肽键连接起来的一类有机物。根据其所含氨基酸残基的数量，有小肽和多肽之分。小肽一般是指不到10个氨基酸所组成的肽，多肽一般是指1050个氨基酸所组成的肽。,（一）肽键与肽链,肽键：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键。,肽键的特性,氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用：肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。组成肽键的原子处于同一平面-肽平面。,肽键的结构特点：酰胺

4、氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个C几乎处在同一平面内（酰氨平面）。肽键亚氨基在pH0-14内不解离。肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型,肽 链,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽链中AA的排列顺序和命名,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N端的氨基酸残基

5、开始，以C端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,旋光性：一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。肽的酸碱性质短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于端和端COOH以及侧链上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。,（二）肽的物理和化学性质,4）原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优 势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。3.肽的化学反应：肽的-羧基，-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应，如茚三酮反应、Sanger反

6、应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应（含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液发生反应生成紫红色或蓝紫色的复合物。氨基酸无该反应）。,（三）天然存在的活性肽,一些小肽在动物体内主要用于合成蛋白质，作为体蛋白的结构组分，因而称之为结构肽(structural peptieds)。另有一些肽类物质，在体内并非用于合成蛋白质，而是独立发挥其特定的生物学功能，一般称之为生物活性肽（bioactive peptides），简称活性肽；也称功能肽（functional peptides)。已为人们广泛熟悉的表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)、成纤

7、维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor,IGF)均为典型的生物活性肽。,1 谷胱甘肽(GSH),GSH的功能,SH缓冲剂：保护血液中的红细胞不受氧化损伤，维持血红素中半胱氨酸处于还原态解毒作用：GHS可与过氧化氢或其它有机过氧化物反应参与氨基酸的转运,2、短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val,3、脑啡肽（5肽）Met-脑啡肽：TyrGlyG

8、lyPheMet Leu-脑啡肽：TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。生物体内寡肽的来源：合成蛋白质的剪切、修饰酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、动物肠道可吸收寡肽,4、肽类激素,一级结构：蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序 表示方法：N-末端向C-末端维持力：肽 键、二硫键,三、蛋白质一级结构的测定,（一）蛋白质测序的策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。1、直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4,2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）,3 测序前的准备工

9、作1）蛋白质的纯度鉴定 纯度97%以上，均一。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 DNScl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸2）测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数 SDS-PAGE 凝胶过滤法 沉降系数法,4 蛋白质测序的一般步骤（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目；（2）拆分蛋白质分子中的多肽链；（3）断裂链内二硫键；（4）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5）鉴定多肽链的N末端和C末端残基；（6）裂解多肽链成较小的肽段；（7）测定各个肽段的氨基酸顺序；（8）确定肽段在多肽链中的顺序；（9）确定多肽链中二硫键的位置。,（二）N 末端和C-末端氨基酸残基的鉴定1 N-末端分析 DNS-

10、cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等 PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。,2 C-末端分析肼解法无水肼NH2NH2 100 5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。,羧肽酶法（Pro不能测）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、Lys N H2N ValSerGly C,图 P11

11、8 羧肽酶法测C末端,（三）二硫桥的断裂 过甲酸氧化：SS+HCOOOH SO3H 巯基乙醇还原（四）氨基酸组成的分析 酸水解的同时辅以碱水解,（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化1 酶裂解法1）胰蛋白酶 Lys X(X Pro)Arg X2）胰凝乳蛋白酶 TyrX(X Pro)TrpX PheX3）嗜热菌蛋白酶 Leu(Trp、Try、Phe）X(X Pro/Gly)4）胃蛋白酶 Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu),2 化学裂解法 溴化氰 MetX 产率85%亚碘酰基苯甲酸 TrpX 产率70-100%NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）XCys 羟胺N

12、H2OH AsnGly 约150个氨基酸出现一次,3、肽段的分离纯化 电泳法 根据分子量大小分离 离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）根据肽段的电荷特性分离 反相法 根据肽段的极性分离 凝胶过滤要求：单带 单峰 端单一（常用c l法）,四 蛋白质的一级结构与生物功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化1 同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序

13、差异就越大。,同源蛋白质的特点：同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。多肽链长度相同或相近,2 细胞色素C 分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩 0人与猴 1人与狗 10人与酵母 44,细胞色素

14、C,功能:传递电子多肽链，血红素，铁原子,胰岛素有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。,3 系统树,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源1 氧合血红素蛋白质丝氨酸蛋白酶类3 功能差异很大的蛋白质,（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂,1、血液凝固中的级联过程,2 凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用,在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274Thr275、Arg323Ile3

15、24断裂，释放出48个a.a，产生活性凝血酶。A链49 a.a B链259 a.a,纤维蛋白原,22r2从二条链和二条链的N端各断裂一个特定的肽键-ArgGly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。,A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。,五、肽和蛋白质的人工合成氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、苄氧酰氯（CBZ-Cl）、对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）;羧基保护：苄酯、叔丁酯（

16、成盐、成酯）;羧基活化：酰氯法（PCL5）、叠氮法、混合酸酐法、活化酯法;缩合剂：DCCI（二环己基碳二亚胺）直接接肽。,第5章 蛋白质的三维结构,决定蛋白质天然构象的3个因素:1)与溶剂分子的相互作用;2)溶剂的pH和离子强度;3)蛋白质的氨基酸序列.每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。蛋白质的氨基酸序列具有重要意义：蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础；蛋白质的一级结构决定它的空间结构；氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病；通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出一些生物亲缘关系。,一 研究蛋白质构象的方法,X射线衍射法光谱学

17、方法 紫外差光谱 荧光和荧光偏振 圆二色性 核磁共振,二 稳定蛋白质三维结构的作用力,蛋白质的折叠和具有生物学功能的蛋白质构象的稳定性依赖于大量的非共价因素，其中包括疏水效应、氢键、范德华力（van der Waals）和离子间相互作用；以及共价交联（二硫键）。,（一）氢 键,氢键的贡献是协同蛋白质的折叠和帮助稳定球蛋白的天然构象。前面已经提到多肽链骨架的羰基和酰胺基之间，特别是在球蛋白内部的那些基团之间常常形成氢键使肽链形成a-螺旋和b-折叠结构。此外在多肽链骨架和水之间，多肽链骨架和极性侧链之间，两个极性侧链之间以及极性侧链和水之间也可以形成氢键。大多数氢键都是N-HO类型的。,蛋白质结构

18、中常见的氢键,（二）范德华力,范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离时才能达到最大。虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。,（三）疏水相互作用,蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开水的现象称之疏水相互作用（hydrophobic 0interaction）或疏水效应（hydrophobic effect）。疏水相互作用在维持蛋白质构象中起着主要的作用，因为水分子彼此之间的相互作用要比水与其它非极性分子的作用更强烈，非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部，而大多数极性侧链在

19、蛋白质表面维持着与水的接触。,（四）盐 键,带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白，虽然这种作用很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，所以是溶剂化的，对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的。,盐 键,（五）二 硫 键,除了氢键以外，共价交联，例如二硫键也有助于某些球蛋白的天然构象的稳定，二硫键有时存在于由细胞分泌的蛋白质中，当这样的蛋白质离开细胞内环境时，由于有二硫键的存在，可使得蛋白质对去折叠以及降解不那么敏感，而维持蛋白质的稳定。,二 硫 键,三 多肽主链折叠的空间限制,氨基酸残基是通过肽键连接形成线性的多肽链的，一个多肽链的骨架是由通过肽键连接的重复单位N-Ca-C组

20、成的，酰胺氢和羰基氧结合在骨架上，而不同氨基酸残基的侧链连接在a-碳上。,酰胺平面,参与肽键形成的2个原子以及另外4个取代成员：羰基氧原子、酰胺氢原子、以及2个相邻的a-碳原子构成了一个肽单位。肽键的部分双键特性防碍了C-N键的旋转，其结果造成肽单位实际上是个平面-酰胺平面。,由于连接在两个a-碳上的侧链基团之间的立体干扰，不利于顺式构象的形成，对伸展的反式构象的形成有利，因此蛋白质中几乎所有的肽单位都是反式构象。,二面角（dihedral angle),一个蛋白质的构象取决于肽单位绕N-Ca键和Ca-C键的旋转，旋转本身受到肽链的主链和相邻残基的侧链原子之间的立体干扰的限制。,一个肽平面绕N

21、-Ca键旋转的角度用F表示，而绕Ca-键旋转的角度用Y表示，顺时针方向为正，反时针为负，理论上F(fai)和Y(fai)可以取180至180之间的任一个角度。当包含a的两个肽键处于同一平面时，F和Y都定义为0。,二级结构：肽主链折叠的规则方式,早在1951年，Pauling和Corey根据对一些简单化合物，例如氨基酸、二肽以及三肽的X-射线晶体图的研究数据，提出了两个周期性的多肽结构：a-螺旋（a-helix）和b-折叠（b-sheet）结构，它们是许多纤维蛋白和球蛋白的主要的二级结构。,（一）a-螺旋,在一个理想的a-螺旋中，每一个氨基酸残基绕螺旋轴上升了0.15nm，每圈螺旋需要3.6个氨

22、基酸残基（一个羰基、3个N-Ca-C单位和一个氮），它们绕螺旋轴上升的距离，即螺距为0.54nm。,在a-螺旋中，相邻的螺圈之间形成链内氢键，多肽链骨架的每个羰基氧（氨基酸残基n）与它后面C-端方向的第四个残基（n4）的a-氨基氮形成氢键，螺旋内的氢键几乎平行于螺旋的长轴，所有的羰基都指向C-末端。,影响a-螺旋形成的原因,氨基酸组成与序列 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。Gly在肽中连续存在时，不易形成螺旋。R基大（如Ile）不易形成螺旋 Pro、脯氨酸中止螺旋。R基较小，且不带电荷的氨基酸利于螺旋

23、的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成螺旋。,pH对螺旋的影响,右手-螺旋与左手-螺旋,右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的-螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（+64、+42）。,（二）b-折叠片,Pauling和Corey提出的b-折叠结构，是一种由伸展的多肽链（称之b链）组成的二级结构。b-折叠又分为平行式（所有肽链的N端都在同一方向）和反平行式（肽链N端一反一正）。,（1）氢键与肽链的长轴接近垂直。（2）多肽主链呈锯齿状折叠构象（3）侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。在a-螺旋中，每一个氨基酸残基绕

24、轴上升0.15nm，但在b-构象中，每个残基大约占0.320.34nm，羰基氧和酰胺氢之间的氢键起着稳定b-折叠结构的作用。,（三）转角及其它,除a-螺旋和b-折叠结构之外，球蛋白还含有一些非重复的三维结构区。非重复区一般是由2至16个氨基酸残基组成，这些非重复区可以连接二级结构和环（loop）处改变肽链折叠的方向，使得蛋白质最终呈现球形。,转角 由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成；主链骨架以1800返回折叠；第一个肽单位上的羰基氧原子与第三个肽单位上的亚氨基氢原子生成一个氢键。,发夹,由一条伸展的多肽链弯曲而成的两条等长、彼此相邻、反向平行的肽段；两条肽段依靠氢键联系，氢键有16个；此构象包

25、含1011个氨基酸残基。,无规卷曲 没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关-螺旋，-转角，-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的、二面角可存在于所有允许区域内。,大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白（Fibrous proteins）和球蛋白（globular proteins）。一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是以三级结构表现出来的，而某些球蛋白的生物学活性则需要四级结构。纤维蛋白的主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体。a-角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白，a-角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分，而胶原蛋白是腱、皮肤、骨

26、骼和牙齿的主要蛋白成分。大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上象一个球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏水的内部环境和一个亲水的表面.,五 纤维状蛋白质,纤维蛋白：是动物体的基本支架和外保护成分。分子对称性差，分子轴比大于10。可溶性：肌球蛋白 纤维蛋白质 不溶性：角蛋白 胶原蛋白 弹性蛋白 球状蛋白：具有多种多样的生物功能。分子对称性佳，分子轴比小于10。溶解度较好。,（一）a-角蛋白,（二）丝心蛋白与折叠,（三）胶原蛋白-三股螺旋,结构特征,肽链的氨基酸顺序多为(Gly-x-y)，其中x残基往往是Pro，y残基往往是Hyp，因此不可能形成螺旋或折叠。三股左手螺旋平行排列，相互绞

27、合，生成右手螺旋。各肽链借助Gly残基的肽键之间形成氢键而交联在一起。,六 超二级结构和结构域,蛋白质分子中存在的由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成在空间上可彼此区别的结构单位充当更高层次结构的构件，与空间结构的运动性有密切关系,超二级结构,也称之基元（motifs），是二级结构的组合结构。这类结构存在于大量的各种不同的蛋白质结构中。超二级结构可能具有一种特定的功能或是作为大的功能单位结构域的一部分。,在二级或超二级结构基础上形成的特定区域，参与蛋白质结构的装配，并与蛋白质的许多功能，如分子间的识别和相互作用等有密切关系折叠单位 功能单位 运动性,结构域,EF手：钙结合蛋白中，

28、含有Helix-Loop-Lelix结构锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸侧链形成的拉链式结构,七 球状蛋白质与三级结构,三级结构是由一个已经具有了某些a-螺旋和/或折叠区的多肽链折叠成一个紧密包裹的、几乎成球形的空间结构，或称为天然构象。,（一）球状蛋白质的分类,（二）球状蛋白质三维结构的特征,1 含多种二级结构单元2 具有明显的折叠层次紧密的球状或椭球状实体疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面5 表面的空穴是活性部位,三级结构的一个重要特点是在一级结构上离得远的氨基酸残基在三级结构中可以靠的很近，它们的侧链可以发生相互

29、作用。二级结构是靠骨架中的酰胺和羰基之间形成的氢键维持稳定的，三级结构主要是靠氨基酸残基侧链之间的非共价相互作用（主要是疏水作用）维持稳定的，此外二硫键也是稳定三级结构的力。在一个蛋白质的三级结构中，二级结构区之间是通过一些片段连接的。,八 膜蛋白的结构,（一）膜内在蛋白,具有单个跨膜肽段的膜蛋白,（二）脂锚定膜蛋白,具有多个跨膜肽段的膜蛋白,九 蛋白质的折叠和结构预测,蛋白质的变性氨基酸序列规定蛋白质的三维结构蛋白质折叠蛋白质结构的预测,（一）蛋白质的变性,环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失，这一过程称为蛋白质变性（denaturation）。,变性因

30、素：有几种方法可以用来使蛋白质变性，例如提高或降低pH；加热蛋白质溶液；苛刻的高温条件，或是用强酸或强碱处理还可能导致蛋白质不可逆的失活。盐酸胍、尿素以及去污剂也会引起蛋白质的变性。变性表现：生物功能丧失，物理和化学性质发生改变。变性机理：破坏次级键，但未改变一级结构。,（二）氨基酸序列规定蛋白质的三维结构,除去变性因素后，在适宜条件下，变性的蛋白质可以从伸展态恢复到折叠态，并恢复全部的生物活性。这种现象称为蛋白复性（renaturation）。可逆变性充分证明了蛋白质的三级结构是由一级结构确定的。,核糖核酸酶A的变性与复性实验,最早研究蛋白质由变性状态经折叠再形成它的天然构象的是Christ

31、ian B.Anfinsen等人。他们用含有2-巯基乙醇的8M脲的变性剂使RNase A变性，导致酶的三级结构和催化活性完全丧失，生成含有8个巯基的多肽链。如果使变性的酶氧化和再折叠，8对巯基可以随机配对的话，那么就有可能生成105种二硫键不同的结构，但具有生物活性的只有一种。事实上当除去还原剂后，在8M脲的环境下氧化，形成的蛋白质中有99都含有不正确的二硫键，而且活性大约是原来酶活性的1。,如果将还原剂和脲同时都除去，并且稀释还原的蛋白和将它于生理pH条件下暴露在空气中，Rnase A会自发地获得它的天然构象，一套正确的二硫键和充分的酶活性。实验表明正确的二硫键只有当蛋白质折叠成它的天然构象

32、后才能形成。如果向含有拼凑的不正确二硫键的失活形式的蛋白质溶液中加入少量的还原剂，然后缓慢加热，也可以复性。,（三）蛋白质折叠,蛋白质是沿着指定途径折叠成其天然构象的，而不是通过随机构象搜索碰到的。蛋白质折叠始于局部二级结构的形成。即,蛋白质表现出一种层次折叠的方式:先形成小的局部结构元件,然后聚集成较大的结构元件,它们之间在进一步形成更大的结构元件。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI)和分子伴侣（molecular chaperones)有利于蛋白质体内折叠。,分子伴侣的作用机制,分子伴侣是结合去折叠和部分折叠肽链的必需蛋白质。Hsp70家族（

33、heat shock protein）陪伴蛋白（chaperonin）,与蛋白质折叠相关的疾病,淀粉样沉积（amyloid deposit):以不溶性蛋白质在脑中或其它组织中的聚积为特征，从而导致某些神经疾病。阿尔茨海默病（Alzheimers disease）：由于-淀粉样蛋白在脑中形成纤维沉积或瘢块。-淀粉样蛋白是从其前体蛋白质上裂解下来的一个40个残基的片段。蛋白质的非正常折叠是一类传染性疾病的致病因素：疯牛病（牛海鳗状脑病bovine spongiform encephalopathy），克-雅病（Greutzfeldt-Jacob disease）及羊骚痒病等。朊病毒蛋白质,朊病毒蛋

34、白质（prion）,Prion:proteinaceous infectious particle在正常脑组织中，主要是-螺旋构象，而在病脑中，变成-折叠和-螺旋的混合物，从而形成损坏脑细胞的不溶性纤维聚积物。朊病毒的感染性是因为异常折叠的朊病毒蛋白质具有催化正常朊病毒蛋白质错误折叠的能力。,Prion生物学,专门研究生物界中一类蛋白质,这类蛋白质至少存在两种构象体,其中某个(或某些)构象体不具有自我增殖(self-propagating)能力,但必需至少存在一种具有自我增殖能力的构象体,这两类构象体往往拥有不同的生理功能.蛋白质也是一种遗传物质,蛋白质储存和传递的生物信息是通过其空间构象来实

35、现的.,（四）蛋白质结构的预测,构象预测：结构设计：蛋白质工程（protein engineering）分子设计的知识依据：1）蛋白质分子间的进化关系；2）蛋白质一级结构与空间结构的关系；3）蛋白质结果与功能的关系。,十 亚基缔合和四级结构,亚基：具有独立的三级结构的多肽链四级结构：各亚基间相互作用并组装成具有生物活性的特定构象四级结构的概念只适用于具有多个亚基的蛋白质，称为寡聚蛋白，所以四级结构指的是亚基的组织。,（一）有关四级结构的一些概念,蛋白质分子的缔合：蛋白质在各结构层次上结合，成为复杂的、更具功能的分子结构形式,（二）四级结构缔合的驱动力,寡聚蛋白亚基之间是通过非共价键连接的，疏水

36、相互作用是将亚基结合在一起的主要的力，静电引力对于亚基的正确排列也有贡献。疏水作用 极性基团之间的氢键和离子键 二硫键,1、同多聚与杂多聚2、同种缔合与异种缔合同种缔合：亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的异种缔合：亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。,（三）亚基之间的缔合方式,（四）四级缔合在结构和功能上的优越性,1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3、提高基因编码的效率和经济性。4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6、适当降低溶液渗透压。7、具有协同效应和别构效

37、应，实现对酶活性的调节。,（五）寡聚蛋白与别构效应,别构蛋白：除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。别构效应：别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。,同促效应（同位效应）：一种配体的的结合对于其它部位结合后续同种配体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同促效应一般是指活性部位之间的效应。同促效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰异促效应（异位效应）：就是别构效应，别构部位与效

38、应物的结合对活性部位的影响。,正协同效性：一种配基的结合促进后续配基的结合，S型配体结合曲线。负协同效性：一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。,蛋白质的结构层次,一级结构：多肽链上的氨基酸排列顺序 二级结构：多肽链主链骨架的局部空间结构 超二级结构：二级结构单位的集合体结构域：多肽链上可以明显区分的球状区域 三级结构：整个多肽链上所有原子的空间排布四级结构：由球状亚基或分子缔合而成的聚合体结构,第6章,蛋白质结构与功能的关系,一、肌红蛋白的结构与功能,哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）

39、和一个血红素辅基组成。球状分子，单结构域。,（一）肌红蛋白的三级结构,8段直的-螺旋组成，分别命名为A、B、CH，拐弯处是由1-8个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。4个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外4个是Ser、Thr、Asn、Ile。血红素辅基，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。,（二）辅基血红素,Fe原子的6个配位键,（三）O2与肌红蛋白的结合,（四）O2的结合改变肌红蛋白的构象,(五)肌红蛋白的氧结合曲线,氧饱和度：,Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K=P50=2torr解离常数K也称为P50，即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。,二 血红蛋白的结构与功能,在血液中结合

40、并转运O2,(一)血红蛋白的结构,1 血红蛋白的亚基组成 4个多肽亚基，每个亚基上都有一个血红素基和一个氧结合部位。成人：HbA：22 98%，HbA2：22 2%胎儿：HbF 22早期胚胎：22,2 血红蛋白的三级结构,接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。、链的三级结构与肌红蛋白的很相似，,（二）O2结合引起的血红蛋白构象变化,氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态,血红蛋白四级结构,存在于四条亚基间的8对作用力,去氧状态与氧合状态构象比较,（三）血红蛋白的氧合曲线,四个亚基之间

41、具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S型曲线,血红蛋白P50=26 torr，肺泡氧压：Po2=100 torr，Y=0.97 肌肉毛细血管：Po2=20 torr，Y=0.25释放氧：Y=0.970.25=0.72肌红蛋白（无协同效应）：Y不足0.1,协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气。,S 型曲线的生理意义,S 型曲线的上部较平坦，说明在肺部，氧分压虽有较大的变化，但血液的氧饱和度没有多大，即存在较多的氧合血红蛋白，因为，在肺部，要求血液中所有的脱氧血红蛋白尽量地结合更多的氧。S 型曲线的中段坡度较大，说明在肌肉中，氧分压即使有很小的下降，血液中的氧饱和度亦有较大

42、的下降，即在肌肉中，氧合血红蛋白能释放较多的氧。S 型曲线恰好满足了肌肉等组织的生理需要。,（四）H+、CO2和BPG对血红蛋白结合O2的影响,血红蛋白上有CO2和BPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO2。波耳效应：增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放，反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+和CO2。,1 波尔效应H+和CO2促进O2的释放,H+的结合部位：Val的氨基 His的咪唑基CO2的结合部位：4个亚基的N末端的氨基它们的结合，有助于血红蛋白脱氧构象的稳定,波尔效应的生理意义,血液流经组织时，由于组织的pH值较

43、低，CO2分压较高，高浓度的H+和CO2有利于氧合血红蛋白分子释放O2，使组织能比单纯的氧分压下降时获得更多的O2。而且，O2的释放又促进了脱氧血红蛋白分子与H+和CO2的结合。当血液流经肺部时，由于肺气泡的O2分压较高，促进脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2。而且，CO2的呼出，有利于氧合血红蛋白的生成。,2 BPG降低血红蛋白对O2的亲和力,BPG（2,3-二磷酸甘油酸）是血红蛋白的负效应物。BPG通过与两个亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。,BPG的影响,无BPG时，P50=1 torr，BPG=4.5mM时，P50=26 torrBPG进一步提高了

44、血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有BPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，BPG降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。,红细胞中的BPG浓度的变化是调节血红蛋白分子对O2的亲和力的重要因素。（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化：BPG升高。（2）血库储血时加入肌苷可转变为BPG。,三 血红蛋白分子病,（一）分子病是遗传的,分子病：由构成生物机体基本物质分子一级结构发生变异而引起的疾病。这种变异来源于遗传物质基因的突变，因此是遗传性的。个体差异：同种生物来源的一种蛋白质，有时存在两种或两种以上的形式，它们的氨基酸序列通常只有一二个残基的差异。,氨

45、基酸的改变与异常血红蛋白,（二）镰刀状细胞贫血病,血红蛋白病：由于或链发生了变化。,Glu to Val,stickl hydrophobic patch,long fibers,（三）地中海贫血,缺少或链。原因：缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因相关基因发生了无义突变或移码突变，产生不正确的链在编码区外的突变导致转录被阻断，或前体mRNA发生不正确加工,四 免疫系统和免疫球蛋白,（一）相关概念,1 抗原抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。抗原性包括免疫原性和抗原特异性。免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。抗

46、原特异性是指与抗体特异结合的能力。抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。抗原决定簇的作用：被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。与相应抗体的Fab结合。,2 抗体 在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。抗体具有两个特点：高度特异性多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10000种抗体存在。,3 抗原抗体反应抗体是2价的，抗原是多价的。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。抗原一抗体比例

47、适中，形成网状的抗原抗体复合物，不可溶。抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。原抗体反应的条件：抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键 等）,免疫复合物的形成和沉淀,（二）免疫球蛋白的结构与类别,1 免疫球蛋白的结构免疫球蛋白是一组即互相联系、有具有巨大多样性的蛋白质。所有的免疫球蛋白都至少含有4个亚基：两条轻链（L）和两条重链（H），（LH）2。相同的两条重链通过链间的二硫键连接呈Y型，相同的两条轻链也分别通过链间的二硫键与重链的Y臂相连。,可变区和稳定区,在不同的抗体分子中，轻链和重链的N-端区有着不同的氨基酸序列，称为可变区（V区，vari

48、able region）；而在C-端区，其氨基酸序列较为恒定，称为稳定区（C区，constant region)。可变区的可变性主要定位于每条链的三个超变区（hypervariable region），在三维结构中，轻链和重链的超变部分在一起成环，形成跨院结合部位。每一可变区的余下部分保持着稳定的序列，一般不直接与抗原相接触，称为框架区（framework region）.,轻链的结构,免疫球蛋白的结构域,每一条轻链含有两个重复性的片段，约有110个氨基酸。它们折叠成两个致密的三维结构域，一个相当于轻链的可变区，另一结构域相当于稳定区。每一条重链含有四个重复性的片段，约有110个氨基酸。它们折

49、叠成四个致密的三维结构域，一个作为可变区，另三个结构域相当于稳定区。,Fab和Fc片段,用木瓜蛋白酶酶解抗体，可产生两个Fab片段和一个Fc片段。Fab（fragment antigen binding):仅有一个抗原结合部位，不能对抗原发生交联。Fc（fragment crystallize）：有效应物部位，能引发抗原的破坏。F（ab）2：用胃蛋白酶水解抗体释放出的片段，它有两个抗原结合部位，仍能够与抗原交联。,2 免疫球蛋白的分类,5类不同的疫球蛋白家族的区别在于它们含有的重链的种类不同，有些情况下它们的亚基结构也不同。,IgM,以五聚体形式存在，它与入侵的微生物结合并活化补体，杀害并吞噬

50、细胞。是动物对一新的抗原作出应答时，第一个产生的免疫球蛋白。,IgG,能够激化补体并启动巨噬细胞。是在初次免疫应答后，特别是在再次免疫应答后血流中的主要免疫球蛋白,IgG是唯一能够通过胎盘的免疫球蛋白，从而为胎儿提供免疫防护。它还可分泌进入母亲乳汁，由新生动物自肠道进入血流，在胎儿出生后继续提供防护。由于初乳中含有一种抗胰蛋白酶因子，可保护免疫球蛋白不被分解，即以大分子被吸收。,IgA,是机体分泌液中的主要免疫球蛋白，是防止这些部位受侵染的一线防卫。血清中的IgA主要是单体，有少量二聚体，也是通过J链联结两个单体的。,分泌型IgA,在唾液、眼泪、初乳及鼻、支气管和胃肠道的分泌液中，有大量的分泌