蛋白质与非蛋白含氮化合物检验.ppt

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1、第二章蛋白质与非蛋白含氮化合物检验,教学内容,第一节 概述,一、血浆蛋白质,1.直接在血液中发挥作用 在血浆中运载弱水溶性物质 维持血浆胶体渗透压 组成血液pH缓冲系统参与凝血与纤维蛋白溶解血浆固有酶在血浆发挥作用,2.需要时进入组织发挥作用对组织蛋白起修补作用组成体液免疫防御系统抑制组织蛋白酶参与代谢调控作用的激素,血浆蛋白质功能,血浆蛋白质的功能分类,运输载体血浆脂蛋白(CM、VLDL、LDL、HDL等)白蛋白转铁蛋白结合珠蛋白血色素结合蛋白铜蓝蛋白视黄醇结合蛋白甲状腺素结合球蛋白皮质素结合球蛋白类固醇激素结合球蛋白,凝血与纤溶蛋白：纤维蛋白原，凝血酶原，凝血因子、，前激 肽释放酶、HMW

2、激肽原，抗凝血酶,纤维蛋白溶酶原等 免疫球蛋白和补体蛋白：IgG、A、M、D、E C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C6、7、C8、C9、B因子、D因子、备解素等,血浆蛋白质的功能分类,蛋白酶抑制物：1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋白酶 2-巨球蛋白等6种以上血浆酶：卵磷脂胆固醇酰基转移酶、假性胆碱酯酶等 蛋白类激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素等,血浆蛋白质的功能分类,血浆蛋白质的电泳分类,醋纤膜电泳或琼脂糖电泳：白蛋白 1球蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白 分辨率高时：可有1和2 2中也可有两条 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，在适当条件下可以分出30多个区带,各电泳区带的主要血浆蛋白质,前

3、白蛋白 甲状腺素转运蛋白 0.20.4g/L白蛋白 白蛋白 35551-球蛋白 1-抗胰蛋白酶 0.92.0 1-酸性糖蛋白 0.51.5 甲胎蛋白 310-5 高密度脂蛋白 1.73.252-球蛋白 结合珠蛋白 0.32.0 2-巨球蛋白 1.254.1 铜蓝蛋白 0.20.5-球蛋白 转铁蛋白 2.03.5 低密度脂蛋白 0.61.55 C4 0.10.4 2-微球蛋白 0.0010.002 纤维蛋白原 2.04.0 C3 0.71.5-球蛋白 IgA 0.74.0 IgG 7.016 IgM 0.42.3 C-反应蛋白 0.008,（一）前白蛋白（prealbumin,PA）,即甲状腺素

4、转运蛋白(transthyretin，TTR)电泳显示在白蛋白前方故名PA，肝脏合成，55kD，半寿期仅2.5天。5070与视黄醇结合蛋白组成复合体。能转运甲状腺素和三碘甲腺原氨酸，大约结合血浆中10的甲状腺激素。必需氨基酸含量很高，是组织修补材料。,（二）视黄醇结合蛋白（retinol-binding protein，RBP）,肝脏合成，仅21kD，半寿期12h携带视黄醇从肝脏转运到各种靶组织。与TTR以1:1比例结合，避免RBP从肾小球滤过，在靶细胞，TTR-RBP降解，视黄醇被摄入细胞，无视黄醇的RBP载体蛋白与TTR无亲和性，被肾小球滤出，肾近端小管细胞吸收并降解。,（三）白蛋白（al

5、bumin，ALB）生化特性,占血浆总蛋白的5768，不含糖，66.3kD由肝脏合成，1114.7g/d，半寿期约1820天 合成储备大，由血浆胶体渗透压和蛋白质摄入量调节 肾病综合征时合成量可增高到正常的300以上遗传性变异可发生电泳迁移率变化，出现双白蛋白区带（大量使用青霉素或水杨酸等药物亦可）,（三）白蛋白生理作用,最重要血浆营养蛋白，胞饮进入细胞，氨基酸合成组织蛋白最重要血浆载体蛋白维持血浆胶体渗透压的最重要成分缓冲酸碱物质的主要血浆蛋白质高度溶于水，能运载许多疏水分子 生理pH中为负离子，每分子带200个负电荷 运输胆红素.长链脂肪酸.胆汁酸盐.前列腺素.类固醇激素 无机离子(如Ca

6、2+、Cu2+、Ni2+).药物(如阿司匹林、青霉素)结合型激素和药物无活性，ALB含量或pH变化时其活性变化,（四）1-抗胰蛋白酶（1-antitrypsin，1AT或AAT）,蛋白酶和抗蛋白酶蛋白酶：清除病原微生物、坏死组织和衰老红细胞 蛋白酶过多或活性过强可破坏正常组织和细胞抗蛋白酶：机体为对抗蛋白酶的异常作用而产生 抗蛋白酶减少可导致某些疾病发生,（四）1-抗胰蛋白酶 生理功能,占血清中抑制蛋白酶活力的90左右能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原蛋白酶 及白细胞释放的溶酶体蛋白水解酶 形成不可逆的酶-抑制物复合体,（四）1-抗胰蛋白酶 AAT的多种遗传表型,至少有75种，表达的蛋白质有M型和

7、Z型、S型 PiMM型最多，占人群95%以上类型：PiMM、PiMS、PiMZ、PiSS、PiSZ、PiZZ 活力：100%、80、60、60、35、15,（五）1-酸性糖蛋白(1-acid glycoprotein，1 AG或AAG),肝脏合成，40kD，又称血清类黏蛋白，含糖约45，包括1120唾液酸，血清黏蛋白的主要成分，黏蛋白是能被 高氯酸和其它强酸沉淀的一组蛋白质。,（五）1-酸性糖蛋白(1-acid glycoprotein，1 AG或AAG),主要的急性时相反应蛋白 急性炎症时增高，与免疫防御功能有关AAG可以结合利多卡因和心得安等 急性心肌梗死时升高，药物结合状态增加 游离状态

8、减少，需要增加药物剂量。,（六）结合珠蛋白（haptoglobin，Hp）生化特性和表型,由肝脏合成，85kD400kD，分子量变化很大22四聚体，亚基不同而形成的四聚体表型 不同亚基有三种遗传表型1F、1s、2，氨 基酸数不同 有些表型的四聚体又形成聚合体，在 电泳中出现多条带,结合珠蛋白的几种遗传表型,表 型 亚单位的结构 组 成Hp1-1(1F)22 80kD，链氨基酸83个 1F1S 2 链氨基酸245个(1S)2 2Hp2-1(1S2 2)n 120kD-200kD的聚合体(1F2 2)n n不同在电泳中呈多条带Hp2-2(2)n 160kD-400kD n=3-8 n不同在电泳中呈

9、多条带,能与RBC中释放的游离Hb结合 每分子Hp结合两分子Hb 防止Hb从肾丢失而保留铁，避免Hb对肾脏损伤。Hp不能被重新被利用，溶血后其含量急剧降低，血浆Hp浓度多在一周内由再生而恢复。,（六）结合珠蛋白 生理功能,由肝实质细胞合成，分子量约720kD血浆最大的蛋白质，不能从血管扩散至细胞外液也是主要的蛋白酶抑制剂能结合并抑制各种类型的蛋白酶，如纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等酶与2MG处于复合物状态时 酶底物为大分子，蛋白水解酶活性被抑制 酶底物为小分子，仍能被2MG-蛋白酶水解,（七）2巨球蛋白(2-acroglobulin，2MG或AMG),（八）铜蓝蛋白（cerulo

10、plasmin,Cp）生化特性,肝实质细胞合成，132kD，2球蛋白每分子含68个铜原子，含铜而呈蓝色95%的血清铜存在于Cp中，另5%呈可扩散状态 血循环中Cp为铜没有毒性的代谢库。,与氧化还原反应有关，既能起氧化作用又能起抗氧化作用。具有铁氧化酶作用，能将Fe2+氧化为Fe3+Fe3+再结合到转铁蛋白上，使铁不具毒性还有抑制膜脂质氧化的作用,（八）铜蓝蛋白 生理功能,（九）转铁蛋白（transferrin，TRF）生化特性,肝细胞合成，79.6kD，区带，半寿期10.5d能可逆结合多价阳离子，如铁、铜、锌、钴等，但已知其对铁的结合具有临床重要性,（九）转铁蛋白 生理功能,从小肠进入血液的F

11、e2+被Cp氧化为Fe3+，再被TRF的载体蛋白结合。每种细胞表面都有TRF受体，对TRF-Fe3+复合物比对TRF的载体蛋白亲和力高得多TRF-Fe3+将大部分Fe3+运输到骨髓合成Hb 小部分则运输到各组织细胞，形成铁蛋白 及合成肌红蛋白、细胞色素等,（十）2-微球蛋白（2-microglobulin，2M，BMG）,存在于各种有核细胞表面，仅11.8kD是HLA的轻链或链，可从细胞表面 尤其是淋巴细胞和肿瘤细胞表面脱落到血浆中从肾小球滤过，再被肾近端小管重吸收和分解,（十一)C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）生化特性,因在急性炎症病人血清中出现的可以结合 肺炎球

12、菌细胞壁C-多糖的蛋白质而命名由肝细胞所合成，115kD电泳分布在慢区带，有时可延伸到区带,不仅结合多种细胞、真菌及原虫等多糖物质 在钙离子存在下，还可以结合卵磷脂和核酸可引发对侵入细胞的免疫调理作用和吞噬作用 结合后的复合体具有对补体系统的激活作用 表现炎症反应,(十一)C-反应蛋白 生理功能,二、体液氨基酸（amino acid，AA）,氨基酸由消化道吸收、体内合成、组织蛋白分解作用：合成蛋白质，转变为其他含氮生物活性物质分解途径：脱氨基成氨及-酮酸(转变为糖、脂肪或分解供能)小部分脱羧基生成CO2和胺类体液氨基酸含量可反映体内氨基酸代谢紊乱情况氨基酸代谢紊乱有遗传性性和继发性,（一）遗传

13、性氨基酸代谢紊乱,为遗传性代谢酶缺陷引起，种类很多 是相关基因突变所致，至今已发现70余种绝大多数疾患罕见，而病情却严重如果诊断足够早，某些疾患可以治疗,1.氨基酸血症（Aminoacidemia）,酶缺陷在氨基酸代谢起点，其催化氨基酸在血中增加 酶缺陷在代谢途径中间，酶催化前的中间代谢物堆积 有时因正常途径受阻，通过旁路代谢的产物可增多氨基酸血症：氨基酸、或其中间代谢物、或其旁路代 谢物在血液中增高称之。如酪氨酸血症、组氨酸血症、精氨酸血症等,2.氨基酸尿症（Aminoaciduria）,血浆增多的氨基酸及其代谢物均从肾小球滤过 超出肾小管重吸收能力从尿排出即为氨基酸尿症 尿液中浓度经常比血

14、浆更高血浆和尿液氨基酸增多可同时存在 称某种氨基酸血症或氨基酸尿症有时是传统习惯肾小管细胞膜存在氨基酸载体转运蛋白 当某种载体缺乏时，相应氨基酸从尿中排出增加 血浆中这些氨基酸浓度可在正常范围或偏低,遗传性氨基酸代谢紊乱的缺陷酶 及其血和尿中增高的成分(带*为尿中氨基酸),疾病名称 缺乏的酶 血浆中增高的成分苯丙酮酸尿症 苯丙氨酸羟化酶 苯丙氨酸、苯丙酮酸I型酪氨酸血症 延胡索酸乙酰乙酸酶 酪氨酸、甲硫氨酸尿黑酸尿症 尿黑酸氧化酶 尿黑酸（轻度）同型胱氨酸尿症 胱硫醚合成酶 甲硫氨酸、同型胱氨酸组氨酸血症 组氨酸酶 组氨酸、丙氨酸甘氨酸血症 甘氨酸氧化酶 甘氨酸支链酮酸尿症 支链酮酸氧化酶 缬

15、氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等胱硫醚尿症 胱硫醚酶 胱硫醚型高脯氨酸血症 脯氨酸氧化酶 脯氨酸精氨酸琥珀酸尿症 精氨酸琥珀酸酶 谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸等精氨酸血症 精氨酸酶 精氨酸胱氨酸尿症 肾小管碱性氨基酸载体*胱氨酸.精氨酸.赖氨酸.鸟氨酸色氨酸代谢综合症 肾小管中性氨基酸载体*所有中性氨基酸二羧基氨基酸尿症 肾小管酸性氨基酸载体*谷氨酸、天冬氨酸亚氨基甘氨酸尿症 肾小管亚氨基酸载体*脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸,（二）继发性氨基酸代谢紊乱,若与氨基酸代谢有关的器官出现严重病变 也可发生某种氨基酸血症或氨基酸尿症见于肝脏和肾脏疾患、蛋白质营养不良、烧伤等肝功能衰竭：支链氨基酸/芳香族氨基酸比值（B

16、CAA/AAA比值）下降继发性肾性氨基酸尿：由肾小管损害、肾近曲小管功能障碍，使氨基酸重吸收减少而引起,三、嘌呤核苷酸（一）嘌呤核苷酸代谢,嘌呤核苷酸的合成：从头合成途径、补救途径嘌呤核苷酸的分解：终产物是尿酸，人类不能再分解,嘌呤核苷酸合成代谢,主要原料：5-磷酸核糖氨基酸一碳单位,二、高尿酸血症（hyperuricemia）,可分为原发性和继发性两类，以前者为多原发性高尿酸血症：遗传性嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍引起 多数由多基因遗传缺陷所致 与代谢综合征也关系密切继发性高尿酸血症：高嘌呤饮食、肾脏疾病、血液病、药物等引起,嘌呤代谢紊乱,在原发性高尿酸血症的病因中约占10主要原因是嘌呤代

17、谢酶缺陷 其中大多数属多基因遗传缺陷，机制不明 由单酶缺陷引起者仅占12,单酶缺陷原因：,次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏 PRPP合成酶亢进G-6-P缺乏，引起G-6-磷酸增多 沿磷酸戊糖途径生成较多PRPP，嘌呤合成增多腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)缺乏 腺嘌呤不能经补救途径合成腺苷酸而出现堆积 腺嘌呤代谢产物2，8-二羟腺嘌呤由尿排出增加 可产生肾结石，不是高尿酸血症,2.尿酸排泄障碍,原发性高尿酸血症中8090具有尿酸排泄障碍肾脏功能大多正常，仅存在尿酸排泄障碍属多基因遗传性疾病，易感基因和发病机制不明确,2.尿酸排泄障碍,肾脏对尿酸盐的排泄有四个阶段：肾小球滤过血浆

18、中的全部尿酸盐 滤液中大部分尿酸盐被近曲小管重吸收 近端小管再分泌尿酸盐 髓绊降支被动重吸收尿酸盐终尿排出尿酸盐只占滤过量的610 总量约为2.4mmol3.0mmol/d肾脏尿酸排泄障碍涉及以上各个过程,3.代谢综合征与高尿酸血症,原发性高尿酸血症与肥胖、原发性高血压、血脂异常、糖尿病、胰岛素抵抗关系密切。高尿酸血症是代谢综合征的一个组成部分肥胖和高甘油三酯血症是高尿酸血症的相关因素 但血液尿酸和TG等之间相互作用的机制仍不清楚,4.高嘌呤饮食,短时间内从饮食摄入大量含嘌呤食物会生成大量尿酸 超过肾脏排泄能力导致血液尿酸升高各类荤菜都含嘌呤，尤其是各种动物内脏和海鲜嘌呤极高：脑.肝.肾.心.

19、蛤蜊.凤尾鱼.沙丁鱼.肉汁等嘌呤较高蔬菜：菠菜.韭菜.扁豆.豌豆.大豆.豆制品等饮料：咖啡、浓茶含一定量嘌呤酒类：啤酒引发痛风的可能性最大，烈性酒次之 葡萄酒基本上不存在这种危险鸡蛋和牛奶含丰富蛋白质而嘌呤较低，水果中嘌呤很少,5.各种肾脏疾病,各种肾小球疾病因肾小球滤过功能等减退慢性铅中毒造成肾小管损害药物竞争性抑制肾小管排泌尿酸：双氢克尿塞/利尿酸/速尿/吡嗪酰胺/小剂量阿司匹林血液乳酸或酮酸等有机阴离子浓度增高：肾小管对尿酸的分泌受到竞争性抑制而排出减少,6.细胞破坏增多,使核酸分解及尿酸生成增多：骨髓增生性疾病核酸合成增加和周转加速白血病、淋巴瘤、红细胞增多症等恶性肿瘤的化疗和放疗后细

20、胞破坏过多溶血性贫血、系统性红斑狼疮、牛皮癣、心肌梗死、肺结核等组织细胞破坏增多,高尿酸血症和痛风的病因分类 类 型 病因或遗传特征原发性高尿酸血症 尿酸排泄减少，占80-90 多基因性常染色体显性遗传 尿酸产生过多 从头合成嘌呤过多(占原发性10-20)多基因性常染色体显性遗传 特异性酶缺陷(占原发性1)青春性原发性痛风 HGPRT部分缺乏，X-连锁 青春期尿酸结石症（突变型）PRS活性增强 Lesch-Nyhan综合征 HGPRT完全缺乏，X-连锁 Con gierke病 葡萄糖-6-磷酸酶缺乏或不足 继发性高尿酸血症 尿酸排泄减少 肾功能减退 慢性肾疾患 肾小球滤过减少 糖尿病肾病 肾小

21、管排泌尿酸减少 高血压、内分泌疾病、有机酸增加、铅中毒肾病 尿酸产生过多 骨髓增殖性疾病：白血病、多发性骨髓瘤、红细胞增多症 慢性溶血性贫血 全身扩散的癌症，恶性肿瘤化疗或放疗 严重的剥脱性牛皮癣,一、体液总蛋白二、体液白蛋白三、血清蛋白质电泳四、免疫固定电泳五、体液个别蛋白质六、体液氨基酸七、体液尿酸,第二节 常用体液蛋白质与非蛋白含氮化合物检测项目,一、体液总蛋白,体液总蛋白包括数量众多的各种蛋白质定量测定时作了如下假定：1.所有血浆蛋白是单纯的多肽链，糖脂类和金 属有机物等均不计在内，其含氮量平均为162.各种蛋白质理化性质虽不同，但与化学试剂的 反应性（如呈色、沉淀）一致。,测定蛋白质

22、时利用蛋白质特有的结构或性质：重复的肽链结构；分子中均含有氮原子；与色素结合的能力；沉淀后借浊度或光折射测定；酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收临床实验室测定体液蛋白质的方法有多种 各种方法性能和应用情况不同 最多用的是双缩脲法，以下将重点介绍,一、体液总蛋白,（一）双缩脲法（biurea method）,【测定原理】蛋白质中两个相邻肽键(-CO-NH-)在碱性溶液与二价铜离子作用产生稳定的紫红色络和物。此反应与双缩脲(两个尿素缩合物H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液与Cu2+作用形成紫红色反应相似。因此将蛋白质与碱性铜反应的方法称为双缩脲法,（一）双缩脲法,【参考区间】随年

23、龄增大有所增高，60岁后则稍有下降。新生儿:4670 g/L，数月到2岁:5175g/L，3岁及以上:6080 g/L。成人:6483g/L(直立行走)和6078g/L(卧床)【临床意义】浓度下降常由白蛋白浓度下降而引起浓度增高见于慢性炎症等多克隆免疫球蛋白增多，以及浆细胞病的单克隆免疫球蛋白增多症。,（一）双缩脲法,【方法评价】（1）特异性：至少含两个-CONH-才能与Cu2+络合，氨基酸及二肽无反应，三肽以上才能反应。体液小分子肽含量极低，可忽略不计。（2）呈色一致性：因呈色强度与肽键数量即蛋白质 含量成正比，故各种蛋白质呈色强度基本相同，此为目前所有总蛋白测定方法中最好。,（一）双缩脲法

24、,【方法评价】（3）临床应用：检测范围10120g/L灵敏度不高，但很适合血清总蛋白浓度对胸腹水总蛋白的检测低限为0.47g/L 生物检测限为1.33g/L 胸腹腔积液TP在4.550 g/L，能采用该法蛋白质浓度很低的脑脊液和尿液无法定量,（二）测定体液总蛋白的其他方法 1.染料结合法,酸性环境蛋白质带正电荷，可与染料阴离子反应而产生颜色改变。染料有氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等，前两种常作血清蛋白电泳的染料。考马斯亮蓝可用于尿液、脑脊液等定量测定，虽简便和灵敏，但比色杯对染料有吸附作用。邻苯三酚红钼法没有考马斯亮蓝法的缺点。各法均存在与不同蛋白质结合力不一致的问题,（二）测定体

25、液总蛋白的其他方法 1.染料结合法 邻苯三酚红钼法（pyrogallol red molybdate，PRM）,原理：在酸性介质中，邻苯三酚红-钼酸盐与蛋白质形成复合物，最大吸收峰从467nm转移至594nm。灵敏度高，检测下限约1020mg/L，上限约2g/L 试剂不吸附比色杯，可用于自动生化分析仪中各种蛋白质呈色程度不同，球蛋白约为白蛋白70 加入适量十二烷基磺酸钠，球蛋白反应性有所升高该法适用于蛋白质浓度低的尿液、脑脊液等,（二）测定体液总蛋白的其他方法 2.凯氏定氮法（Kjeldahl method）,1883年建立，是经典的蛋白质测定方法。原理：测定样品中的含氮量，推算出蛋白质含量。

26、蛋白质中含氮量较为恒定，平均16,即1克氮相当于6.25克蛋白质。准确性好，精密度高，灵敏度高，适用于任何形态的样品测定，至今仍被认为是测定许多生物样品中蛋白质含量的参考方法。但操作复杂、费时，不适合临床常规测定。,（二）测定体液总蛋白的其他方法 3比浊法（turbidimetry）,某些酸如三氯乙酸、磺基水杨酸等能与蛋白质结合而产生微细沉淀，由此产生的悬浮液浊度大小与蛋白质的浓度成正比。优点是操作简便、灵敏度高，可测定尿液、脑脊液等蛋白质较低的样品。缺点是影响浊度大小的因素较多，包括加入试剂的手法、混匀技术、反应温度等，且各种蛋白质形成的浊度亦有较大的差别。,（二）测定体液总蛋白的其他方法

27、3比浊法 苄乙氯铵法,是目前临床上较多应用的比浊法原理：苄乙氯铵在碱性条件下与蛋白质形成沉淀，其悬浮液稳定，660nm 处进行浊度测定。灵敏度、准确度、对白蛋白和球蛋白的反应一致性都优于其他比浊法，检测范围较广。精密度仍不够理想。,（二）测定体液总蛋白的其他方法 4.酚试剂法（phenol reagent method）,Folin在1921年首创，用于酪氨酸和色氨酸测定 后由吴宪用于蛋白质定量原理：蛋白质中酪氨酸和色氨酸使磷钨酸和磷钼酸还原为钨蓝和钼蓝。灵敏度较高各种蛋白质酪氨酸和色氨酸含量不同，如ALB含色氨酸0.2，球蛋白色氨酸23 因此只适合测定单一蛋白质。受还原性物质干扰(带-SH化

28、合物、糖类、酚类等),（二）测定体液总蛋白的其他方法 5直接紫外吸收法,根据蛋白质在280nm或215/225nm紫外吸收值，计算蛋白质含量。蛋白质浓度（g/L）1.45A280nm-0.74A260nm 准确性受蛋白中芳香族氨基酸含量影响甚大 而且尿酸和胆红素在280nm附近有干扰。不适合血清、尿液等组成复杂的体液蛋白质，常用于较纯的酶、免疫球蛋白等测定。,二、体液白蛋白,【检测方法】包括电泳法、免疫化学法和染料结合法。电泳法只能测其百分含量，乘TP浓度得其浓度 用于ALB定量不方便且精密度不如直接定量免疫化学法包括免疫比浊法和放射免疫法等 特异性好、灵敏度高，ALB易纯化、抗血清易制备，适

29、合尿液和脑脊液等低浓度ALB的测定血清ALB测定可采用染料结合法,二、体液白蛋白,【检测方法】染料结合法 原理：阴离子染料溴甲酚绿(bromcresol green，BCG)溴甲酚紫(bromcresol purple，BCP)能与ALB结合，其最大吸收峰发生转移。BCG与ALB形成的蓝绿色复合物在630nm处有吸收峰，BCP与ALB形成的绿色复合物在603nm处有吸收峰。而球蛋白基本不结合这些染料。,二、体液白蛋白,【参考区间】随年龄有所变化，04天：2844 g/L 4天14岁：3854 g/L，此后下降成人：3552 g/L，60岁为3246 g/L 走动者比卧床者平均高3 g/L【医学

30、决定水平】：35gL时正常 2834gL为轻度缺乏 2127gL为中度缺乏 21gL则严重缺乏 低于28gL时，会出现组织水肿,【临床意义】ALB增高仅见于严重失水时，无重要临床意义低ALB血症见于下述许多疾病情况：（1）白蛋白合成不足：严重肝脏合成功能下降如肝硬化、重症肝炎 蛋白质营养不良或吸收不良ALB受饮食蛋白质摄入量影响，可作为营养状态的评价指标，早期缺乏时不易检出。,二、体液白蛋白,【临床意义】（2）白蛋白丢失：尿中丢失如肾病综合征、慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病、系统性红斑狼疮性肾病等 胃肠道蛋白质丢失，因黏膜炎症坏死 皮肤丢失如烧伤及渗出性皮炎等（3）白蛋白分解代谢增加：组织损伤如外

31、科手术和创伤 组织分解增加如感染性炎症疾病等,二、体液白蛋白,【临床意义】（4）白蛋白的分布异常：门静脉高压时大量ALB从血管内漏入腹腔（5）无白蛋白血症：极少见的遗传性缺陷，血浆ALB含量常低于1g/L,二、体液白蛋白,【方法评价】（1）两种染料结合法均操作简便、重复性好（2）特异性BCG与ALB为快反应，30秒基本完全 血清和球蛋白能起慢反应，程度较ALB低 缩短反应时间能避免非特异性反应BCP与ALB即时完全反应 无球蛋白非特异性干扰 但BCP与牛、猪等ALB的反应性比人ALB程度低,二、体液白蛋白,【方法评价】（3）临床应用：两法均适合于血清白蛋白测定BCP法检测范围为550g/L，上

32、限较低BCG法检测范围为560g/L，应用更方便BCG法测定胸腹腔积液ALB检测低限为0.44g/L 生物检测限0.98g/L，胸腹腔积液1.535 g/L 能采用BCG法测定尿液和脑脊液ALB定量则不适宜采用该法,二、体液白蛋白,三、血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis,SPE）,【检测原理】pH 8.6缓冲液中血清中各种蛋白质都电离成负离子，在电场中向正极移动；因各种蛋白质pI不同，在相同pH下带电荷量有差异，各蛋白质分子大小与分子形状也不相同，故在同一电场中泳动速度不同。血清蛋白质被分成5个主要区带 从正极起依次为ALB、1、2、球蛋白,三、血清蛋白电

33、泳,【参考区间】白蛋白57681球蛋白1.05.72球蛋白4.911.2球蛋白713球蛋白9.818.2不同染色剂和电泳条件参考区间不同 各实验室应建立自己的参考区间,正常人SPE图谱,三、血清蛋白电泳,【临床意义】1.血清蛋白电泳异常图谱,三、血清蛋白电泳,【临床意义】2.血清蛋白电泳典型图谱（1）肾病型：ALB下降，2显著升高 明显升高，不变或相对下降（2）肝硬化型：ALB下降，明显升高 典型者和区带融合，见-桥,肾病型,肝硬化型,三、血清蛋白电泳,【临床意义】3.免疫球蛋白增多（1）单克隆免疫球蛋白增多：或间色泽深染的窄区带,单克隆免疫球蛋白或其轻链或重链片段，称M蛋白(monoclon

34、al protein)，见于浆细胞病。M蛋白电泳位置大致反应Ig类型，IgA位于区后部或和之间，IgM位于区中部，IgG位于区后部。,三、血清蛋白电泳,【临床意义】3.免疫球蛋白增多（2）多克隆免疫球蛋白增多为各种合成Ig细胞的全面增殖 区带呈弥散性升高见于慢性肝病、肝硬化、结缔组织病、慢性感染、恶性肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、淋巴母细胞性淋巴结病。,三、血清蛋白电泳,【方法评价】影响精密度的因素很多，如电泳介质性质，缓冲液成分和浓度、电压大小、电泳时间、染色液成分、电泳时温度。实验室之间的精密度较差，实验室内精密度也远不如生化指标定量测定。采用自动电泳仪及其配套的商品试剂，每次电泳时电压.时

35、间.甚至温度等都能准确控制，精密度明显提高。,四、蛋白质免疫固定电泳（Immunofixation electrophoresis,IFE）,能确定蛋白质的单克隆属性，从而诊断浆细胞病等检测标本可以是血清、尿液、脑脊液或其他体液以血清蛋白免疫固定电泳较多用,四、蛋白质免疫固定电泳,【检测原理】包括蛋白电泳和免疫沉淀两个过程电泳：同一份标本加样在6个不同位置。加抗血清：抗IgG、IgA、IgM、链和链分别加到各 份电泳区带表面孵育，在适当的区带位置抗 原抗体复合物形成并沉淀。清洗：电泳区带中未被固定的ALB.1.2.球蛋白，及未结合的游离抗原或抗体被洗去。染色：考马斯亮蓝等灵敏度较高的染色液。观

36、察：有否单克隆免疫球蛋白，其抗原特异性、电泳位 置、该蛋白质量及其与其他蛋白质的大概比例。,四、蛋白质免疫固定电泳,【区带表现】对照电泳见血清蛋白电泳区带第2至6份电泳分别显示IgG、IgA、IgM、链、链与其相应抗体的蛋白质复合物区带。正常区带染色程度依次是IgGIgA和链链IgM，均呈宽而弥散的区带。单克隆蛋白为边界清晰的局部致密条带，条带宽度和深度与其含量成正比，多数出现在或区，偶见于区。,四、蛋白质免疫固定电泳,【临床意义】恶性浆细胞病诊断；与多克隆增殖的鉴别诊断；脑脊液寡克隆蛋白的判断。恶性浆细胞病包括骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、重链病、原发性淀粉样变性等。各种单克隆蛋白频率：IgG

37、52.IgA21.IgM12.IgD2.IgE0.01.轻链(或)11.重链(.或)1，两种或多种克隆蛋白0.5,四、蛋白质免疫固定电泳,【方法评价】检测速度较快，整个过程约1.5至2h敏感性高，能检测到0.51.5g/L的单克隆抗体分辨率高，很短的电泳距离分离出单克隆蛋白组分抗原抗体沉淀模式对照常规血清蛋白电泳模式分析区带，结果较容易判断但良性M蛋白血症(BMG)也表现为类似的单克隆条带,五、体液个别蛋白质,【检测方法】蛋白质都由氨基酸组成，性质相似，除ALB等极少数因有某种特性可用，能用染料结合法外，都需制备特异性抗体，用免疫化学法测定。包括免疫比浊法、发光免疫法、放射免疫法、酶免疫法等。

38、灵敏度均很高，适用于血、尿、脑脊液等大部分标本，目前以免疫比浊法最多用。,五、体液个别蛋白质免疫比浊法,原理：体液中的某种蛋白质与其特异性抗体 形成抗原抗体复合物使反应液出现浊度 反应液保持抗体过量时复合物随抗原量增加 反应液浊度随之增加，与一系列校准品对照计算免疫比浊法包括透射比浊法和散射比浊法透射比浊法检测反应终点或一定时间后吸光度值散射比浊法检测入射光遇到复合物后呈一定角度散射的光量，常测定浊度形成的速率。,五、体液个别蛋白质,【参考区间】参见表2-2。【临床意义】1.血浆PA 下降是肝功能不全的灵敏指标。指示蛋白质营养不良：200mg/L400mg/L正常 100mg/L150mgL

39、轻度缺乏 50mg/L100mgL 中度缺乏 50mgL 严重缺乏,五、体液个别蛋白质,【临床意义】2.RBP 血浆RBP增高见于肾小球损伤血浆RBP下降见于：急性时相反应、肝脏疾病和蛋白质营养不良尿液RBP排泄量增加可反映肾小管功能损害,五、体液个别蛋白质,【临床意义】3.血浆AAT（1）AAT缺陷与肺气肿PiZZ型、PiSZ型个体常出现年青时肺气肿低血浆AAT还可出现在胎儿呼吸窘迫综合征（2）AAT缺陷与肝病：新生儿PiZZ型和PiSZ型与其胆汁淤积、肝硬化和肝细胞癌的发生有关PiZZ表型的某些成人也会发生肝损害,五、体液个别蛋白质,【临床意义】4.血浆AAG 作为急性时相反应的指标 在风

40、湿病、恶性肿瘤及心肌梗死等炎症或组织坏死时48h后浓度迅速增高 35天时出现高峰，一般增加34倍,五、体液个别蛋白质,【临床意义】5.血浆Hp（1）溶血性疾病：含量明显下降；因参考范围较宽，一次测定价值不大，需连续观察。生化组合试验：血浆Hp、LDH和游离Fb；血管外溶血可使后两者增高，Hp则不会变化。（2）烧伤和肾病综合征：ALB大量丢失时，大分子Hp可代偿性明显增加。但Hp1-1（两个均为1表型）个体选择性蛋白尿时血浆Hp通常下降,五、体液个别蛋白质,【临床意义】6.血浆2MG 低白蛋白血症尤其是肾病综合征时 血浆2MG含量可显著增高 可能为代偿机制以保持血浆胶体渗透压,五、体液个别蛋白质

41、,【临床意义】7.血浆Cp 主要作为Wilson病的辅助诊断指标Wilson病：一种常染色体隐性遗传病，因血浆Cp减少，血浆游离铜增加并沉积在肝引起肝硬化，沉积在脑基底节豆状核导致豆状核变性。该病又称为肝豆状核变性。患者：血清总铜降低、游离铜增加、尿铜增加,五、体液个别蛋白质,【临床意义】8.血浆TRF 贫血的鉴别诊断和铁缺乏的治疗监测：缺铁性低血色素贫血时，TRF代偿性合成增加；血浆铁低，结合到TRF的铁少，铁饱和度下降（正常参考值为3038）再生障碍性贫血，血浆TRF正常或低下 红细胞对铁的利用障碍，使铁饱和度增高,五、体液个别蛋白质,【临床意义】8.血浆TRF总铁结合力(total ir

42、on binding capacity,TIBC)血浆蛋白质对铁的结合容量(主要是TRF对铁结合容量)，单位与血清铁相同。铁饱和度（）血清铁/TIBC 两者尤其是后者对贫血诊断和鉴别诊断更好,五、体液个别蛋白质,【临床意义】9.BMG 血浆BMG增高：见于肾衰竭、炎症、肿瘤 尤其是与B淋巴细胞相关的肿瘤尿液BMG排泄量增加：可反映肾小管功能损害,五、体液个别蛋白质,【临床意义】10.血浆CRP（1）急性时相反应极灵敏的指标：在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润等时迅速显著增高，心肌梗死612h即升高，可达正常水平的2000倍。5mg/L作为明显的炎症信号15mg/L为慢性低程度

43、的炎症或急性时相反应始,五、体液个别蛋白质,【临床意义】10.血浆CRP（2）做为心血管疾病的独立危险因子为血浆CRP低浓度增高，须用更灵敏测定方法大多健康成年人3.0mg/L 为高度危险性。,五、体液个别蛋白质,【方法评价】免疫比浊法检测限为1020mg/L精密度较好，批内变异系数通常小于5需加促聚剂聚乙二醇加速大的免疫复合物形成抗原或抗体量大大过剩时易出现可溶性复合物受血脂影响，尤其是低稀释度时，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使测定值假性升高。,五、体液个别蛋白质,【方法评价】免疫化学法已应用于许多体液蛋白质测定 ALB、PA、AAT、AAG、HAP、AMG、CER、TRF、CRP、IgG、I

44、gM、IgA、C3、C4和1抗糜蛋白酶共15种蛋白质均已有国际公认的标准参考物质CRM470（Certified Reference Material）。免疫球蛋白轻链和、2-mG、1-mG、RBP、IgD、IgE等，也可采用免疫比浊法测定,六、体液氨基酸（一）过筛试验检测氨基酸,1氨基酸薄层层析 能将体液中氨基酸分离，并常用茚三酮显色 大多数氨基酸与茚三酮反应呈紫色,六、体液氨基酸（一）过筛试验检测氨基酸,2尿氨基酸颜色试验,六、体液氨基酸（一）过筛试验检测氨基酸,3.Guthrie微生物试验 琼脂培养基中含有能特异针对某种待检氨基酸的竞争性抑制剂，结构与待检氨基酸相似。将枯草芽孢杆菌芽孢加

45、入，样品点到纸片上并放到琼脂表面，琼脂板孵育后观察细菌生长。若有高浓度待检氨基酸，氨基酸抑制剂的作用减弱或被克服，能观察到菌株生长。将系统设计成待检氨基酸超过其参考上限时显示细菌生长，来检测疾病。,六、体液氨基酸（二）氨基酸定量,1色谱法 GC法：样品用量少、灵敏和快速，但在仪器所具有的温度下可挥发性低。临床实验室应用少HPLC法：分辨率和灵敏度均高，分析时间相对短，较广泛地应用于体液氨基酸的测定。,六、体液氨基酸（二）氨基酸定量,2.酶法 L-苯丙氨酸：L-苯丙氨酸脱氢酶法 L-苯丙氨酸氧化酶法，生成醌亚胺苯丙酮酸：L-苯丙氨酸脱氢酶法。谷氨酰胺：谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶催化。支链氨基酸（亮

46、氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）：亮氨酸脱氢酶法，氧化脱氨生成酮酸，NAD还原成NADH,七、体液尿酸,【检测方法】早期常采用氧化还原法，以磷钨酸法较常用，特异性差，临床实验室已不再采用。尿酸酶紫外吸收法是测定尿酸的参考方法。尿酸酶-过氧化物酶法：目前常采用 原理：尿酸酶氧化尿酸生成尿囊素和H2O2，后者在过氧化物酶催化下，使2，4-二氯酚和4-氨基安替比林缩合生成醌类有色化合物。,七、体液尿酸,【参考区间】1血清尿酸 男性210420mol/L，女性150350mol/L2尿液尿酸 膳食嘌呤含量对尿酸排出量影响很大无嘌呤膳食：男2480mol/d，女稍低低嘌呤膳食：男2830mol/d，女2360m

47、ol/d高嘌呤膳食：5900mol/d均衡膳食：14804430mmol/d,七、体液尿酸,【临床意义】1血清尿酸 为发现高尿酸血症，后者的主要危害是引起痛风2尿尿酸排出量 可判断肾脏排泄尿酸的能力 分析高尿酸血症是否由肾脏排泄障碍所引起,七、体液尿酸,【方法评价】尿酸酶-过氧化物酶法过氧化物酶催化反应特异性较差，维生素C、胆红素等还原性物质有负干扰。血清尿酸浓度在几百mol/L水平，远低于血糖、总胆固醇等，胆红素等负干扰容易被观察到。试剂中加入胆红素氧化酶能消除胆红素干扰。可用于血清和尿液尿酸测定 检测上限约为700mol/L，尿液尿酸应稀释测定,一、蛋白质代谢紊乱的生物化学诊断,蛋白质的变

48、化与人类许多疾病密切相关病理情况下血浆蛋白质的变化资料已越来越多随技术发展许多微量血浆蛋白质分析已较容易,第三节 体液蛋白质与非蛋白含氮化合物检测的临床应用,（一）肝脏疾病的血浆蛋白质变化,1.多种血浆蛋白质含量下降 ALB为血浆中含量最多的蛋白质，是肝病最常用的蛋白质指标，因半寿期长而不很灵敏，在严重慢性肝炎、肝硬化以及重症肝炎时有明显下降。PA是肝脏合成功能的敏感指标，肝功能下降时显著降低。肝病时血浆胆碱酯酶因合成减少而降低。其他如转铁蛋白、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、1-酸性糖蛋白等在肝功能明显下降时也可出现减少。,（一）肝脏疾病的血浆蛋白质变化,2.凝血蛋白质和凝血酶原时间(PT)严重肝脏疾

49、病有明显Fg缺乏和某些凝血因子减少凝血酶原时间是真正的功能性试验，延长提示严重肝功能障碍，对肝合成功能的快速变化敏感。PT对轻微的肝细胞功能障碍不敏感，急性病毒性或中毒性肝炎若PT延长，是爆发性肝衰竭早期指标。,（一）肝脏疾病的血浆蛋白质变化,3.免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）增高 慢性肝病网状内皮系统受损或门静脉旁路形成时升高急性肝炎轻度升高，慢性活动性肝炎和肝硬化显著升高 尤其是自身免疫性肝炎IgG升高常见于慢性活动性肝炎IgA升高常见于各种肝硬化，酒精性肝硬化时尤其显著原发性胆汁性肝硬化IgM大量升高 病毒性肝炎早期可出现IgM升高,（二）对某些疾病的重要诊断意义,1.遗传性蛋白合

50、成缺陷与疾病 年轻肺气肿者应检测1-抗胰蛋白酶是否缺陷wilson病时可能存在铜蓝蛋白遗传性合成减少2.贫血的诊断和鉴定 缺铁性贫血患者转铁蛋白升高溶血性贫血时结合珠蛋白减少,（三）急性时相反应（acute phase reaction，APR）,急性时相反应 是对炎症(如感染、自身免疫性疾病等)和组织损伤(如创伤、手术、心肌梗死、肿瘤等)的非特异性反应，血浆蛋白质如AAT、AAG、Hp、Cp、C4、C3、Fg和CRP等显著升高或升高，PA、ALB、TFR出现下降。这些血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白（acute phase proteins,APPs）增加的蛋白质称为正向APPs 下降的蛋白