荧光红外酶标仪.ppt

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1、,16.1 光学仪器简介 16.2 酶标仪的原理应用及操作16.3 荧光光谱仪原理应用及操作16.4 红外光谱仪原理应用及操作,16 酶标仪、荧光光谱仪、红外光谱仪的使用,16.1 光学仪器简介,一、光学知识回顾,1可见光的颜色和互补色：在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。,白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。,2物质的颜色与吸收光的关系：当

2、白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。,三原色 RGB红绿蓝 印刷的三原色是RGB的互补色yellow黄，cyan青，magenta品红（或者叫洋红、红紫,光分析法：基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法；电磁辐射范围：射线无线电波所有范围；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；光分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可取代的地位；,二、光分析法及其特点,三个基本过程：,（1）能源提供能量；（2）能量与被测物

3、之间的相互作用；（3）产生信号。基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。,三、电磁辐射的基本性质,1.电磁辐射的波动性,散射,折射与反射,衍射,干涉,偏振,波 长 cm、m、nm、A 频 率 Hz sec-1波 数 cm-1 传播速度 cm/sec,2.电磁辐射的粒子性,3.普朗克(Planch)公式,光电效应 康普敦效应 黑体辐射,一).电磁辐射的波粒二象性,E-光子的能量 J,焦耳-光子的频率 Hz,赫兹-光子的波长 cmC-光速 2.99791010 cm.s-1h-Planch常数 6.625610

4、-34 J.s 焦耳.秒,E=h=h c/,c=/,吸收,发射,C=299,792,458米/秒,莫斯鲍尔光谱法:-射线原子核-射线吸收,X-射线吸收光谱法:X-射线/放射源原子内层电子（n10)X-射线吸收X-荧光光谱法:X-射线原子内层电子 特征X-射线发射,远紫外光-真空紫外区。此部分光谱会被空气吸收,二)光学分析法波谱,近红外光谱区:配位化学的研究对象,红外吸收光谱法:红外光分子吸收,远红外光谱区,电子自旋共振波谱法:微波分子未成对电子吸收,核磁共振波谱法:射频原子核自旋吸收,三)、本章仪器所用的光波,酶标仪、荧光分光光度计,红外分光光度计,-射线5140 pm X-射线10-310n

5、m 远紫外光10200nm微波0.1100cm，射频1100 m（核磁共振）,2.电磁辐射的吸收与发射,A.原子光谱 线光谱 Line spectra,半宽度10-210-5,原子吸收光谱,原子发射光谱,=hc/E=hc/(E1-E0)=h,1.物质的能态,原子、离子 分子,E=E1-E0=hc/,B.分子光谱 带光谱 Band spectra 有机、无机分子,半宽度20100nm,分子吸收光谱,分子发射光谱,半宽度20100nm,E=E电子+E振动+E转动+E平动=h(电子+振动+转动+平动)=hc/(电子+振动+转动+平动),四、光分析法仪器的基本流程,光谱仪器通常包括五个基本单元：光源；

6、单色器；样品；检测器；显示与数据处理；,五、光学分析仪器定量方法,Lambert Beer 定律,A lgT lg（It/I0)=b c,式中：A：吸光度；T:透射率；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位molL-1；：摩尔吸光系数，单位Lmol-1cm-1；,16.2 酶标仪的原理应用及操作,变相的光电比色计或分光光度计,酶标仪（MicroplateReader）是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显示，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的

7、浓度。酶标法又称固相酶免疫测定，含3个必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物。双抗体夹心法(抗原）、间接法（抗体）、竞争法（抗原或抗体）。,1、酶标仪简介,2、酶标仪能干什么？,酶标仪广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中 酶联免疫检测试剂盒 RCH（IgG和IgM）检查通常也称为优生优育十项检查；T3、T4、TSH、TORCH系列、不孕系列、各种癌症标志物、伤寒、副伤寒；另外通过母婴传播的性传播疾病（如淋病、梅毒、HIV）和肝炎（如HBV、HCV），以及胎儿的抗体，新生儿TSH的测定，疫苗反应等。,免疫诊断方法：放免（RIA）、酶免（EIA）和

8、发光 国内 衰退期 成长期 进入期 国外 淘汰 饱和期 成熟期,3、酶标仪的结构,常用的三种检测方法,（一）抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。具体操作步骤如下：,（1）特异性抗体与固相载体联结固相抗体洗涤杂质。（2）受检标本与固相抗体接触反应标本中的抗原与固相抗体固相抗原抗体复合物洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体。固相载体上带有的酶量就代表标本中受检抗原的量。（4）加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物变为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。,二价及以上大分子抗原的检出和定量分析，不能用于半

9、抗原等小分子的测定,（二）间接法 其原理为利用酶标记的抗体来检测已与固相抗原结合的受检抗体。操作步骤如下：,（1）特异体抗原固相载体联结 固相抗原洗涤除去杂质。（2）稀释的受检血清中的特异性抗体固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后固相载体上只留下特异性抗体。（3）酶标抗免疫球蛋白（酶标抗体），与固相复合物中的抗体结合，该抗体间接地标记上酶。清洗后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。（4）加底物显色，颜色深度代表标本中受检抗体量。,（三）竞争法,竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此，结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成正

10、比。,（1）特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。然后洗涤。（2）待测管中加入受检标本与一定量的酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。若受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。若受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。这样，受检标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。“参考管”中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。然后洗涤。（3）加底物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考管中颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本中抗原的量。

11、待测管越淡，表示标本中抗原量越多。,一、盛装比色液的容器不是使用比色皿，而是塑料微孔板。塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作，它对抗原或抗体有较强的吸附；二、酶标仪的光束是垂直通过待测液的；三、酶标仪通常不使用A而是使用光密度OD来表示吸光度。,酶标仪和普通光电比色计的不同,1、仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置、低于40分贝的环境下。2、为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。3、操作时环境温度应在1540之间，环境湿度在15%85%之间。4、操作电压应保持稳定。5、操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。6、保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。,4、酶标仪工作环境,5、酶标仪操作注意

12、事项,1、使用加液器加液，加液头不能混用。2、洗板要干净。最好使用洗板机洗板，避免交叉污染。3、严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。4、测量时勿碰酶标板，以防挤伤。5、勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完毕后要洗手。6、具有污染性、毒性和生物学危害的样品或试剂，严格按照操作说明，以防对操作人员造成损害。用后并及时清洗和消毒。7、不得在测量过程中关闭电源。8、使用后盖好防尘罩。9、切勿擅自拆卸酶标仪。,16.3 荧光光谱仪原理应用及操作,西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为

13、可爱的天蓝色(第一次记录荧光现象)。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。,一、历史,原子荧光光谱法是1964年以后发展起来的分析方法。原子荧光光谱法是以原子在辐射能激发下发射的荧光强度进行定量分析的发射光谱分析法。所用仪器与原子吸收光谱

14、法相近。,中国自主知识产权的光谱分析仪器，世界第一台原子荧光光谱仪诞生在中国（北京海光仪器公司）,荧光光谱法分为原子荧光和分子荧光两种,荧光分光光度计的发展经历了手控式荧光分光光度计，自动记录式荧光分光光度计，计算机控制式荧光分光光度计三个阶段；荧光分光光度计还可分为单光束式荧光分光光度计和双光束式荧光分光光度计两大系列。其他的还有低温激光Sh p olskill荧光分光光度计，配有寿命和相分辩测定的荧光分光光度计等,分子的活化与去活化,外转移,内转移,荧光,系间窜跃,磷光,反系间窜跃,迟滞荧光,振动弛豫,.无辐射跃迁的类型,振动弛豫:Vr 10-12sec外 转 移:无辐射跃迁回到基态内 转

15、 移:S2S1能级之间有重叠系间窜跃:S2T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 S2,.辐射跃迁的类型,共振荧光：10-12 sec荧 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec迟滞荧光:10210-4 sec,二.荧光的发光类型,起源于基态的共振荧光,热助共振荧光,1.共振荧光发射与吸收线波长相同的荧光,起源于基态的直跃线荧光,起源于亚稳态的直跃线荧光,正常的阶跃线荧光,热助阶跃线荧光,起源于亚稳态阶跃激发荧光,起源基态阶跃激发荧光,2.非共振荧光荧光的波长与激发光不同时,Stores荧光:直跃线荧光、阶跃线荧光 Anti-stores荧光：阶跃激发荧光,三、主要组成及部

16、件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,消除散射光和入射光的干扰,荧光分光光度计的类型,历程：手控式荧光分光光度计、自动记录式荧光分光光度计和计算机控制式荧光分光光度计。类型：单光束、双光束荧光分光光度计、低温激光Shpolskill荧光分光光度计、配有寿命和相分辩测定的荧光分光光度计等。主要产品：天津港东生产的F-380型、F-320型、F-280型；天津拓普生产的WFY-28型荧光分光光度计；上海精密生产的970CRT型荧光分光光度计；上海棱光生产的F96型荧光分光光度计 等,日本岛津RF-531PC 11

17、万日立F-4500 21.2万原子荧光PF6-3 9.9万,仪器光路图,该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。,四.荧光分析的应用,1.无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10;,某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W,荧光熄灭测定法,铜、铍、

18、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。,.有机化合物,3.生物化学及生理医学方面的应用 因荧光法有很高的灵敏度和较好的特效性，在生物化学及生理医学方面有重要应用。例：用荧光法研究氨基酸和蛋白质。虽然游离氨基酸中能产生荧光的只有几个带苯环的氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯基丙氨酸，然而，某些蛋白质含有荧光辅酶(Fluorescent coenzyme)，荧光辅酶生色剂可用于许多蛋白质的荧分析中。例：镇静剂利血平具有荧光，它还可氧化成具有更强烈荧光的产物再进行分析。

19、,紫外-可见分光光度计:,荧光分光光度计:,紫外-可见分光光度计测量池(吸收池),荧光分光光度计样品池,I0,It,I0,It,IF,p,16.3 红外光谱仪原理应用及操作简介,一、概述,1、红外光谱起源 1800年英国天文学家Hershl用温度计测量太阳光可见区内外的温度时，发现红色光以外的黑暗部分温度比可见光部分高，从而认识到在可见光光波长波方向末端还有一个红外光区。红外光发现以后，逐步应用到各个方面，例如红外检测器、红外瞄准镜、红外理疗仪、红外热像仪等。而许多化学家则致力于研究各种物质对各种不同波长红外光的吸收程度，用于推断物质分子的组成和结构。,1892年发现，凡是含有甲基的物质都会强

20、烈地吸收波长3.4m的红外光，从而推断凡是在该波长处产生强烈吸收的物质都含有甲基。这种利用样品对不同波长红外光的吸收程度研究物质的分子组成和结构的方法，称为红外分子吸收光谱法。到1905年前后，人们已系统研究了数百种化合物的红外吸收光谱，并总结了一些物质分子基团与其红外吸收带之间的关系。1930年有人用群论和量子力学方法计算了许多简单分子的基频和键力常数，发展了红外光谱的理论研究。,2、红外光谱的定义：红外光谱属分子吸收光谱。样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收其中一些频率的辐射，分子振动或转动引起偶极矩的净变化，使振-转能级从基态跃迁到激发态，相应于这些区域的透射光强减弱，记录百分透

21、过率T%对波数或波长的曲线，即红外光谱。主要用于化合物鉴定及分子结构表征，是有机化合物的结构解析的重要工具，根据有机化合物红外特征吸收频率，确定化合物结构中基团；亦可用于定量分析：依据特征峰的强度变化进行定量分析。,分子中基团的振动和转动能级跃迁产生的吸收光谱。红外光谱也称分子的振、转动光谱。,近红外光谱区：1980S低能电子能级跃迁含氢原子团：-OH、-NH、-CH伸缩振动的倍频吸收峰稀土及过渡金属离子配位化学的研究对象适用于水、醇、高分子化合物、含氢原子团化合物的定量分析,红外吸收光谱法：分子的振动、转动基频吸收光谱区 应用最为广泛的红外光谱区,远红外光谱区：气体分子的转动能级跃迁液体与固

22、体中重原子的伸缩振动晶体的晶格振动某些变角振动、骨架振动-异构体的研究金属有机化合物、氢键、吸附现象研究该光区能量弱,较少用于分析,3.红外光谱区的划分（0.751000m）,SW-NIR:750-1100nm；LW-NIR:1100-2526nm,光源,单色器,吸收池,样品,检测器,数据处理和仪器控制,1组成结构框图,硅碳棒,一）、色散型红外吸收光谱仪的基本组成,二、红外吸收光谱仪,与双光束UV-Vis仪器类似，但部件材料和顺序不同。,前置放大,滤光片型、分光型、傅立叶变换型等；测量光：漫反射型、透射测量型、漫透射型,TOC5000A总有机碳分析仪,二）、非色散型红外吸收光谱仪,用滤光片代替

23、单色器，用于快速、单组分的测定。,滤光型红外光度计：大气中有机物卤代烃、光气、氢氰酸、丙烯腈非滤光型红外光度计：单一组分如CO、CO2,三、试样的制备,试样中的微量杂质(0.11%)可以不需要进行处理，超过0.11%，就需分离出去微量杂质。,分离体提纯的方法：重结晶、精馏、萃取、柱层析、薄层层析、气液制备色谱等。,一）、试样的前处理与提纯,对于一些难提纯的混合组分，也要尽可能地减少组分数。,二）、气体样品,气体、蒸气压高的液体、固体或液体分解所产生的气体，都可以用气体池测定。,对于含量较低的气体还可以采用多重反射气体池进行测定。,窗片,2.吸收池的形状,波长范围,容易破碎,3.使用注意事项,三

24、）、液体样品,用溶剂CS2、CCl4、CHCl3等溶解吸收很强的液体后，再液膜法进行测定。主要起稀释作用。注意：溶剂化效应、溶剂自身的红外吸收峰。,液膜0.015 mm以下时，可以借助窗片的附着力，使其自然形成液膜。,1样品池的类型,固定池、可拆池、可变厚度池、微量池,2液体样品的制备,(1)液膜法,固定池：用于易挥发性液体的测定。,可拆池：用于高沸点、粘稠型液体的测定,液膜厚度的选择：脂肪族碳氢化合物 0.02mm 卤化物、芳香族化合物 0.01mm 含氧、氮的有机物 0.005mm 含硅、氟的有机物 0.03mm,(2)溶液法,四）、固体样品,1压片法,KCl、KBr在加压下呈现所谓冷胀现

25、象并变为可塑物，在中红外光区完全透明，因此常用作固体样品的稀释剂。,稀释剂的比例：样品/稀释剂 1/100,稀释剂的要求：纯度高、粒度小于2.5m、不含水分。,油压机压力：510107Pa(510t/cm2)；加压同时要抽去空气。,光散射现象较严重,制得的晶片须无裂痕，局部无发白现象，如同玻璃般完全透明，否则须重新制作。晶片局部发白，表示压制的晶片厚薄不匀；晶片模糊，表示晶片吸潮，水在光谱图3450cm-1和1640cm-1处有吸收峰。,3薄膜法(1050m),熔 融 法：对于熔点较低，而且热稳定性好的样品，可以采用此法。,常用于高分子有机化合物的测定。,2糊状法,选取与试样的折射率相近的液体

26、分散介质与固体粉末混合研磨制成糊膏，然后用液体池进行测定。减少了光散射现象。固体有机化合物的折射率一般在1.51.6。常用的液体分散介质：液体石蜡油(nd=1.46)、六氯丁二烯(nd=1.55)、氟化煤油 这些液体分散介质自身也有各自的吸收峰。,溶液成膜法：将试样溶解于沸点较低的溶剂中，然后将溶液分布在成膜介质（水银、玻璃、塑料、金属板)上，让溶剂蒸发后形成试样膜。,近红外光谱分析的应用,漫反射测量固体和粉末样品：部分光线直接经镜面反射离开外，有部分在样品内经反复的反射、吸收、衍射等过程重新从表面逸出，形成漫反射光。漫反射光包含样品物质结构、形态等信息。无损检测、快速、样品制备简单。球积分仪或特定的漫反射载样装置。使用化学计量学、数学方法建立模型。应用：食品、农产品、高分子材料、化工制药、石油化工等的测定（相对稳定组成、具体测量目标已知的样品，且样品数量较大）。如食品中蛋白质、脂肪水分的测量、化工原料的纯度测量等,