荧光分析法在药物分析中的应用.ppt

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1、荧光标记法在药物分析中的应用及小动物活体成像技术在药物研发领域的应用,概述：,发光分析是分子发光光谱分析的简称,化学发光分析（包括生物发光）,分子荧光分析,分子磷光分析,荧光分析法在药物分析中的应用,20世纪70年代以来，特别是近年来相继出现的各种灵敏度高的荧光分析法已有效地用于药物制剂以及生物体液中药物的分析。如同步扫描荧光技术可用于违禁品中苯丙胺和吗啡加奎宁的测定；荧光偏振免疫分析法可用于血清中的庆大霉素、地答新、茶叶碱、五巴比妥、苯巴比妥等多种药物的检测，还可进行烧伤患者体内萘替米星的药代动力学研究；特异性荧光偏振免疫法可用来监测肾移植后环孢素A的全血浓度；荧光猝灭法用来测定苦参碱和氧化

2、苦参碱的含量；固体表面荧光测定法用于血清中茶叶碱，以及其它多种抗菌药、抗气喘病药、抗惊风病药等的临床荧光分析；电解荧光光度法测定片剂中卡马西平的含量等等。其中，荧光探针技术已经发展成为借助荧光显微镜在分子水平上进行实时检测的重要手段。这种技术灵敏度高，可视性强，而且对研究的生物大分子或细胞干扰少，因此得到广泛应用。,荧光分析法的特征：,荧光发射光谱的形状与发射波长无关,斯托克位移,在溶液光谱中观察到的荧光发射光的波长总是大于激发光的波长。,改变不同的激发波长，同一荧光物质的发射光谱形状不变。,灵敏度高,一般比紫外-可见吸收光谱法高2-4个数量级。,操作简单,取样量少、重现性好。,一 该物质必须

3、具有与所照射光线相同频率的吸收结构；二 该物质吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。,常规的荧光分析法可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。直接荧光测定法是利用物质自身发射的荧光进行定量测定，而物质分子自身产生荧光必须具备两个条件:,几种常用于药物分析的荧光分析法：,直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的物质，便可通过药物的荧光强度变化来测定其浓度和含量。因荧光性质与溶液的pH值有关，所以研究体系荧光强度的测定须在适宜的介质溶液中进行，pH对体系荧光强度的强弱影响甚大。已用于直接荧光分析法测定的药物有盐酸洛呱丁胺、双水杨酸等。,直接荧光法,对于有些药物的测定可以利用其

4、对某一特定的有荧光性的体系的荧光淬灭作用对其进行定量分析和测定。庞志功等建立了测定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法。荧光淬灭法还用于对梭基苯丙酮酸、司帕沙星、甲硝哇等药物的含量进行分析。,荧光淬灭分析法,日常生活中，大部分药物没有荧光性。衍生化荧光分析就是借助化学反应将待测的某种药物接上某种特定的化学基团，去掉某种化学基团，或者改变某种特定基团，己达到改变待测药物的物质结构，从而改变待测药物的荧光特性之目的，提高待测物灵敏度的分析方法。,衍生化荧光分析法,有些有机配体与金属离子形成的配合物能产生刚性平面结构，这种结构的物质能发射荧光。而我们平常用的药物很多都含有有机配体，所以可以通过改变有机配

5、体的结构而达到改变药物结构的目的。这些配体绝大多数为芳香族化合物：例如-OH，-NH2，-SH，-COOH，-OR，-O，-NR3等，这些官能团能与金属离子形成稳定的五元或六元环配合物。,利用金属络合的反应进行衍生,氧化还原反应是还原剂将电子转移给氧化剂，其结果是有机物质分子结构发生改变，使其产生荧光或荧光强度增强。,利用氧化还原反应进行衍生,有时利用荧光分析法在药物测定过程中，需要使用具有刚性平面结构的芳香族化合物或者结构类似的杂环化合物作为荧光衍生剂。这些荧光衍生剂与有机物的活性基团(如羟基、氨基、羧基)发生反应，使反应体系的荧光性增强，或产生荧光产物。例如：利用NBD-F与青霉素反应产生

6、荧光，而测定青霉素的含量。另外，荧光衍生化反应还可以与色谱技术连用来测定一些药物的含量。例如：Gholamreza利用此方法检测阿其霉素、加巴喷定、托吡酯。,利用荧光衍生剂进行衍生,胶束增敏荧光分析法是在胶束溶液中对药物的含量进行测定的荧光分析方法。表面活性剂的作用之一是在溶液中产生胶束环境，胶束环境对物质分子有如下作用:(l)胶束环境对分子极性较小的弱荧光物质具有一定程度的增溶作用，所以对于此类物质，可用表面活性剂作为增溶剂;(2)胶束环境对有一定荧光性质的物质分子的荧光发射具有增敏增稳作用，因此，对于此类物质，可用表面活性剂对其作用，使其起到增敏增稳的效果。综合以上分析，对于某些几乎没有荧

7、光性或荧光性很弱的药物用直接荧光方法无法进行分析测定时，可以通过使用表面活性剂产生胶束环境，从而使该药物的荧光强度得到一定程度的增强。,胶束增敏荧光分析法,常用的环糊精(cyclodextrin，CD)就是一种可以产生胶束环境的物质，它是环状低聚葡萄糖类化合物，其结构分子内腔属于疏水性的，结构分子外腔属于亲水性的。由于该物质结构分子主客体的特征，以及该物质所处环境的温度、物质结构表面所带的电荷及该物质分子周围其它分子和离子等所形成的微环境有利于该物质形成胶束环境，胶束环境的存在，大大降低了有一定荧光性质的物质分子的非辐射速率，因而使该荧光物质分子的荧光性增强。利用此种方法测定土霉素、吡哌酸、醋

8、酸甲萘氢醌、盐酸芦氟沙星、双喀达莫、盐酸左氧氟沙星、左炔诺孕酮、曲克芦丁等药物。,荧光动力学分析法主要包括催化荧光动力学和非催化荧光动力学两种类型。催化荧光动力学法是以催化反应为基础来测定某种物质浓度或者含量的方法。非荧光动力学催化法是通过测量非催化反应的速率而测定某种反应物(分析物质)的浓度或者含量，常用于一些有机物质的分析测定。,荧光动力学分析法,物质分子吸收辐射光后，分子中的电子从最高占有轨道转移到该物质的另一个最低空轨道中，这种转移的过程叫电荷的转移。能形成电荷转移的物质分子必须有两部分，一个为电子给予体，另一个为电子接受体。近年来，荷移荧光光谱法在药物分析中得到了非常广泛的应用。文献

9、报道用荷移荧光光谱分析法测定的有洛美沙星、加替沙星、环丙沙星、诺氟沙星、吡哌酸等药物。,荷移荧光光谱分析法,同步扫描技术与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长。由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图，这种用同步扫描技术得到的光谱称为同步荧光光谱。同步荧光分析法按光谱扫描方式的不同可分为恒(固定)波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。和常规荧光分析法相比，同步荧光分析法具有谱图简化、选择性提高、光散射干扰减少等特点，它不仅可以对单一的药品进行分析，如异黄嘌呤、甲氧苄啶、依诺沙星等，还可以同时测定多种结构相似的药品。,同步荧光分析法,几种荧光分析的新

10、技术和新方法：,导数荧光分析法记录的是待测物质荧光强度对波长的导数(包括一阶或更高阶导数)，从而获得相应的导数荧光的分析方法。利用导数荧光光谱法对物质的浓度或者含量进行分析测定方法称为导数荧光分析法。已经利用此种分析方法同时测定了多种氨基酸，维生素B，氧氟沙星对映体，环丙沙星等。,导数荧光分析法,化学计量学是数学、统计学、计算机技术和化学相结合的交叉学科。荧光分析法易受到散射光的干扰，无法同时分析混合物。化学计量学正好解决了这个问题。,化学计量学方法,在现代分析化学技术中，多种分析仪器和检测方法的联用技术大大提高了分析检测的灵敏度，降低了检出限，达到了很好的效果。其中发展较快的有色谱一荧光检测

11、技术和流动注射一荧光检测技术等。,荧光联用技术,荧光分析法的发展方向：,荧光分析法是一种重要且有效的光谱分析手段。该方法具有经济、简便、灵敏度高和选择性好的优点，目前己被广泛用于药物的测定，发展的主要趋势是从复杂组成的样品(包括体液)中简便、灵敏、快速、可靠地检测一些痕量成分。随着生活水平的提高和科学技术的大力发展，药物对人类的作用也更加重要，这就对药物的分析方法提出了更高的要求。要求荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展。,1)进一步系统地寻求和合成专属性强、灵敏度更高、效果更好的荧光探针；2)开辟多组分药品物质同时快速、准确检测的方法以及深入研究其反应机理；3)与计算机技术紧

12、密结合，研制出自动化程度高，获得和处理信息速度快、检测速度更快、效果更好的荧光分析仪器；4)逐步加强与其他各种现代化的分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏更专一和更低检测限获得药物相关信息，迅速测出药物的含量和检出限。,小动物活体成像技术,动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究。动物活体成像技术主要分为可见光成像(optical imaging)、核素成像(PETSPECT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、计算机断层 摄影(computed tomography，CT)成 像 和超声

13、(ultrasound)成像五大类。活体成像技术是在不损伤动物的前提下对其进行长期的纵向研究，成像技术可 以提供 的数据有绝对定量和相对定量两种。检测信号不随其在样本中的位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI 和 PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像 中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范 畴，但可以通过严格设计实验来定量。其中，可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和 CT则适合于解剖学成像，称为结构成像；MRI 介 于功能成像和结构成 像之 间。,1、可见光成像,体内可见光成像包括生物

14、 发光与荧光两种技术。生物发光技术是用荧光素酶基 因标记 DNA，利用其产生的蛋 白酶与相应的底物发生生化反应，产生生物体内的光信号而荧光技术则采用荧光报 告基 因(G F P、RF P)或荧光染料(包括荧光量子点等新型纳米标记材料)进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光，就可以形成体内的生物光源。生物发光是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而荧光则需要外界激发光源的激发。,这个技术主要应用于药物研发的以下几个方面：1 观察肿瘤细胞的早期生长和转移及其对药物的反应；2 观察相关基因的表达，建立病理模型，研究其对药物的反应；3 观察病毒和细菌对体内的侵染及以病毒为载体

15、的基因治疗在体内的表达；4 观察蛋白及多肽药物在体内的相互作用及其药代动力学研究；5 观察干细胞，免疫细胞，神经细胞和其他细胞在动物体内的生长，转移和其他变化。,2、核素成像,正电子发射断层成像技术(positron emission to mography，PET)和单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography，SPECT)是核医学的两种显像技术。,小动物PET SPECT与其他分子显像方法相比，还具有以下显著优势：一是具有标记的广泛性，有关生命活动的小分子、小分子药物、基因、配体、抗体等都可以被标记；二是绝对定量；三是对于

16、浅部组织和深部组织都具有很高的灵敏度，能够测定感兴趣组织 中 P-摩尔甚至 f-摩尔数量级的配体浓度，对于大鼠的检测很便；四是可获得断层及三维信息，实现较精确的定位；五是小动物PETSPECT可以动态地获得秒数量级的动力学资料，能够对生理和药理过程进行快速显像；六是可推广到人体。,3、小动物 C T,CT利用组织密度的不同造成对x射线透过率不同，对机体一定厚度的层面进行扫描，并利用计算机重建三维图像。小动物 CT(微型cT)作为一种最新的cT成像技术，具有微米量级的空间分辨率(大于9um)，并可以提供三维图像。,4、小动物 MRI,MRI 依据所释放的能量在物质内部不同结构环静中不同的衰减，绘

17、制出物体内部的结构图像。相对于CT，MRI具有无电离辐射性(放射线)损害、的软组织分辨能力，以及无需使用 比剂 即可显示血管结构等的独特优点。对于核素和可见光成像，小动物MRI的优势是具有微米级的高分辨率及毒性；在某些应用中，MRI能同时获得生理、分子解剖学的信息，这些正是核医学、光学成像的弱点。对于小动物研究，小动物MRI是一个功能强大、多用途的成像系统，但是 MRI 的敏感性较低(微克分子水平)，与核医学成像技术的纳克分子水平相比，低几个数量级，所以它不是最理想的成像系统。随着多模式平台的发展，如MRIPET，可以从一个仪器中得到更全面的信息。,5、小动物超声,超声基于声波在软组织传播而成像，由于其无辐射、操作简单、图像直观、价格便宜等优势，在临床上广泛应用。在小动物研究中，由于所达到组织深度的限制和成像的质量容易受到骨或软组织中空气的影响而产生假象，所以超声不像其他动物成像技术那样应用广泛，应用主要集中在生理结构易受外界影响的膀胱和血管，此外小动物超声在转基因动物的产前发育研究中有很大优势。,