苯硫脲尝味的群体遗传学调查.ppt

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1、苯硫脲尝味的群体遗传学调查,1.实验目的,（1）测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。（2）了解酶切扩增多态序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）（又称为PCR-RFLP）技术的原理，学会用CAPS 技术检测单核苷酸多态性（SNPs）。在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。（3）计算群体中PTC 尝味的基因频率，判断群体是否达到Hardy-weiberg 平衡。,2.实验原理,苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物（图2.1），为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺

2、基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,0001/50,000 PTC 浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲“尝味者,只能尝出PTC 浓度大于1/24,000 溶液的味道（甚至对PTC 的结晶物也尝不出苦味）的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”,图2.1 苯硫脲结构图,PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7 号染色体上（7q35-7q36）的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38 决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1750,000 16,000,000的PTC 溶液的苦味，杂合子(Tt)只能尝出1

3、480,000l380,000 的PTC 溶液的苦味。因此可以利用对PTC 的尝味能力测定家族中的基因传递和人群中的基因频率。,2.2 人类苯硫脲尝味的基因人类的 PTC 尝味基因Homo sapiens taste receptor,type 2,member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38 或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：一处是145 位，味盲者为G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）；第二处是785 位，味盲者为T

4、785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）；第三处在886 位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile），尝味者为G886（编码缬氨酸val）。因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262，被称为AVI 等位基因，而尝味者的三处是pro49、ala262 和val262，被称为PAV 等位基因（图2.2，2.3）,味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1 的识别位点（识别序列5-GCNGC-3），如果是尝味者，则其第785 位SNP 恰好形成了一个额外的Fnu4H1 识别位点（GCTGC）。因此可以利用这个SNP 造成的

5、限制性位点多态性，设计引物扩增包含785 位SNP 位点的PTC 基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。,3.实验技术路线,4.实验步骤4.1 讲解实验目的、实验原理、实验技术路线；实验方法及注意事项；主要仪器设备使用方法、注意事项；（提前一周讲解，给学生准备时间）（1）讲解实验目的、实验原理、实验技术路线。（2）讲解口腔上皮细胞总DNA 的快速提取、基因PCR 扩增、DNA 电泳、PCR产物纯化、DNA 酶切、遗传学分析等实验方法及注意事项。（3）讲解高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电

6、泳槽、涡旋振荡器、磁力搅拌器、电子天平、PCR 仪、微波炉、紫外分光光度计、电磁炉、恒温水浴锅、恒温干热议、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、恒温振荡摇床、37培养箱、pH 计、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱等主要仪器设备以及必须的电脑软件的使用方法、注意事项；,4.2 PTC 尝味能力的测定4.2.1 实验材料4.2.1.1 主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、冰箱。洁净、经121高压灭菌20min 的容量瓶、量筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次性医用无菌PE 手套、乳胶手套、塑料滴管，一次性纸杯，记号笔。4.2.1.2 试剂和材料（1）材料：受试者为

7、全体修读遗传学大实验的学生。（2）试剂：苯硫脲（PTC）结晶，娃哈哈纯净水.4.2.1.3 溶液配制（1）原液（1 号液）：称取PTC 结晶0.65 g，加娃哈哈纯净水500 ml，在室温(20左右)下溶解l2d（经常摇晃）（或60水浴中1 h 充分溶解），PTC 浓度约为1750，过滤灭菌。（2）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原液214 倍，编为2-14 号（表4.1）。将配好的14 种浓度的PTC 溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过的100 ml 螺口试剂瓶中另取娃哈哈纯净水作为第15 号液。,4.2.2 实验方法（1）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴23 滴 15 号液于受试者舌根部，让

8、受试者慢慢咽下反复咂嘴品味液体尝味，然后用纯净水做同样的试验，交替给受试者尝味，避免受试者的臆意猜测而影响结果的准确。（2）询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。（3）若不能鉴别或鉴别不准，则依次用 141 号溶液重复试验，直到能明确鉴 别出PTC 的苦味为止。,（4）复尝味3 次，3 次结果相同时，才是可靠。（5）记录所品出苦味的液体的编号和稀释浓度。4.3 人口腔上皮细胞总DNA 的提取4.3.1 实验材料4.3.1.1 主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、涡旋振荡器、高速离心机、恒温振荡摇床、微量移液器、电磁炉、冰箱、-80超低温冰箱、计时器、pH 计

9、。洁净、经121高压灭菌20min 的量筒、烧杯、螺口试剂瓶、牙签、1.5 mL灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌PE 手套、乳胶手套、口罩，记号笔。,4.3.1.2 试剂和材料（1）材料：每实验小组选取1 名受试者，用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。（2）试剂：灭菌水，pH 标准液，细胞基因组DNA 提取试剂盒4.3.2 实验方法（1）在1.5 ml 灭菌微量离心管中加入100 L 灭菌水。（2）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在灭菌水中漂洗。（3）涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s，（4）离心机瞬时离心10 s。（5）沸水浴中煮沸5 min。（6）离心机13

10、200rpm 离心2 min。（7）基因组DNA 4C 保存备,4.4 PCR 扩增PTC 基因片段4.4.1 实验材料4.4.1.1 主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋振荡器、PCR 仪、pH 计、制冰机、超净工作台、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。洁净、经121高压灭菌20min 的1.5 mL 灭菌微量离心管、PCR 管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，PCR 管架，一次性医用无菌PE 手套，塑料饭盒，记号笔。4.4.1.2 试剂和材料（1）材料：每实验小组受试者口腔上皮细胞基因组DNA（2）试剂：Taq DNA 聚合酶，dNTPs，灭菌超纯水，Tris

11、碱，Na2EDTA.2H2O，pH 标准液（pH7.0）。PCR 引物委托上海生工生物技术有限公司合成，预期扩增产物303 bp。上游引物：hPTC Forward 5-aactggcagaataaagatctcaatttat-3下游引物：hPTC Reverse 5-aacacaaaccatcacccctatttt-34.4.1.3 溶液配制（1）PCR 引物储存液：将装有引物干粉的离心管13200rpm 离心20s，按照引物合成报告单的说明，在超净台中加入适量TE 缓冲液，溶解引物配制成100M浓储液。（2）PCR 引物工作液：取10L PCR 引物储存液，灭菌水稀释至100L，配制制成1

12、0M 工作液。（3）TE 缓冲液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0,4.4.2 实验方法（1）从制冰机中盛取碎冰（0C），从冰箱中取出所需试剂，在碎冰中解冻（2）将试剂在涡旋振荡器上涡旋振荡混匀10 s（3）13200rpm 离心10 s。（4）在碎冰上按照配方和顺序在PCR 管中配制PCR 缓冲液（为保持酶活性，及PCR 扩增的特异性和效率，始终在低温下配制）灭菌超纯水 31.5L10PCR Buffer（Mg2+free）5.0L25 mM MgCl2 3.0L10 mM dNTPs 1.0L10M hPTC Forward Primer

13、 1.0L10M hPTC Forward Primer 1.0LTaq DNA 聚合酶 1.0L（建议多位学生合配以上混合液，然后分装43.5 ul）受试者口腔上皮细胞基因组DNA 6.5L总体积 50L（5）盖盖后用手指轻弹管壁，混匀液体，13200rpm 离心10 s（将液体甩到离心管底部）。（6）在管上做好标记后放入PCR 仪中（等待其它学生一起运行）。（7）按下述程序设定运行PCR 仪：94C 94C 55C 72C 72C 4C预变性5 min 变性30s 退火 30 s 延伸30s 延伸10 min 无限40 个循环（8）PCR 产物4C 保存备用,4.5 PTC 基因PCR 扩

14、增产物的电泳检测4.5.1 实验材料4.5.1.1 主要仪器设备高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。洁净、经121高压灭菌20min 的、微量移液器吸头（枪头），离心管架，PCR管架，三角瓶，一次性医用无菌PE 手套，记号笔，保鲜袋，微波炉用手套，三角瓶，搪瓷盘。4.5.1.2 试剂和材料（1）材料：受试者PTC 基因PCR 产物（2）试剂：Tris 碱，冰乙酸，Na2EDTA.2H2O，溴化乙锭，琼脂糖，Marker I4.5.1.3 溶液配制（1）50TAE 电泳缓冲液（储存液，pH

15、约8.5）：Tris 碱 242g，57.1ml 冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，去离子水定容至1L（2）1TAE 电泳缓冲液（工作液）：取50TAE 电泳缓冲液，去离子水稀释50倍（3）0.5mg/ml 溴化乙锭（EB）（1000储存液）：50mg 溴化乙锭溶于100mL ddwater，4C 避光储存）。(4)溴化乙锭（EB）工作液：0.5mg/ml EB（1000储存液），去离子水稀释1000倍。（注：EB 为扁平分子，可以嵌入DNA，为潜在诱变剂，接触时须带一次性医用无菌PE 手套，但也不是洪水猛兽，不小心溅到皮肤上时，不会被皮肤吸收只是停留在表面，用大量流水冲洗即可）。

16、4.5.2 实验方法（1）配制1.2%琼脂糖凝胶：称取0.6g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热，并不断取出混匀，注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，直至完全熔解（烫，戴手套）。50ml 正好倒一块大胶（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。,（2）将胶液置桌面上室温冷却致热但不烫手（约50-60C）。（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可。在桌面上静置10-20 分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（4）取1 片光

17、面纸，点5L 灭菌水、2L 6加样缓冲液，再加入5L PCR 产物制成10L DNA 样品。（5）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10l 的吸液头分别依次加入5L Marker I对照，各小组12L PCR 产物电泳样品（互相比较）（6）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至120V(10V/cm)，电泳2030min。（注意正负电极的位置连接正确）。（7）把凝胶小心放入盛有EB 的搪瓷盘中，染色10 分钟后，取出用自来水浸泡10min。（8）放入凝胶成像系统中拍照。,4.6 PTC 基因PCR 产物酶切4.6.1 实验材料4.6.1.1 主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋振

18、荡器、磁力搅拌器、恒温水浴锅、恒温干热议、制冰机、紫外分光光度计、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。洁净、经121高压灭菌20min 的1.5 mL 灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌PE 手套，塑料饭盒，记号笔。4.6.1.2 试剂和材料（1）材料：受试者PTC 基因PCR 产物（2）试剂：限制性内切酶Fnu4H14.6.2 实验方法（1）提前2 h 将恒温水浴锅或恒温干热仪(或恒温水浴锅)电源打开，调节工作温度稳定至37 C。（2）从制冰机中盛取碎冰（0C），从冰箱中取出所需试剂，在碎冰中解冻（3）将试剂在涡旋振荡器上涡旋振荡混匀10 s（4）瞬时离心10

19、s。（5）取1L 受试者 PTC 基因纯化DNA，用紫外分光光度计测定其260nm、280nm 下的紫外吸光光度值，进行DNA 定量分析。（6）在碎冰上按照配方和顺序在1.5 mL 微量离心管中配制酶切缓冲液（为保持酶活性及DNA 切割效率，始终在低温下配制）：灭菌超纯水 补足15L10酶切缓冲液 1.5L5 units/L Fnu4H1 1LPTC 基因纯化DNA 1g（根据DNA 定量结果加入适当体积溶液）总体积 15L（7）37C 恒温酶切过夜（8）酶切产物4C 保存备用,4.7 PTC 基因酶切产物的电泳检测4.7.1 实验材料4.7.1.1 主要仪器设备高速离心机、小型瞬时离心机、电

20、泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。洁净、经121高压灭菌20min 的微量移液器吸头（枪头），离心管架，三角瓶，一次性医用无菌PE 手套，记号笔，保鲜袋，微波炉用手套，三角瓶，搪瓷盘。4.7.1.2 试剂和材料（1）材料：受试者PTC 基因酶切产物（2）试剂：Tris 碱，冰乙酸，Na2EDTA.2H2O，溴化乙锭，琼脂糖，Marker I4.7.2 实验方法（详见）（1）配制2%琼脂糖凝胶：称取1g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热熔解，制胶。（2）取1 片光面纸，点4L 灭

21、菌水、1L 10加样缓冲液，再加入5L PCR 产物制成10L 对照DNA 样品（一块胶上点1 个PCR 产物对照即可）。（3）将酶切产物（离心管中）中加入3L 6加样缓冲液，混匀（4）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10l 的吸液头分别依次加入5L Marker I对照，10L PCR 产物对照，各小组10L 酶切产物电泳样品（互相比较）（4）70V，电泳6070min。（注意正负电极的位置连接正确）。（5）凝胶EB 染色10 分钟后，取出用自来浸泡10min。（6）放入凝胶成像系统中拍照。,4.8 实验结果遗传学分析对照 DNA ladder Marker 的指示条带位置，查看PCR 产物和酶

22、切产物的泳道中各有几条带（图4.1）。PCR 产物预期只有一条约300 bp 的带。酶切产物中如果只有一条与PCR 产物同样位置的带，说明是tt 纯合体（303 bp）；如果只有两条带，一条暗淡，在前方较远处（64 bp），另一条明亮比PCR 产物带稍靠前（238bp），说明是TT 纯合体；如果有三条带，一条明亮、与PCR 产物位置相同，另一条比PCR 产物带稍靠前，还有一条暗淡、在前方较远处，则说明是Tt 杂合体把该结果与此前的尝味结果（尝出苦味的PTC 浓度）对比（表4.4）。综合全班的PTC 基因型，计算基因频率，用X2 检验本班群体是否处于遗传平衡。,表4.4 PTC 尝味能力调查表,

23、5.实验报告查阅 PTC 尝味研究文献，按照科研论文的格式撰写实验论文，包括论文题目、摘要（中英文）、前言、材料与方法、结果、讨论、参考文献。6.实验扩展（选作）请自行查阅 chimpanzee,lowland gorilla,orangutan,crab-eat-ing macaque(anold world monkey),black-handed spider monkey(a new world monkey)的PTC 基因和其SNP 位点以及有关PTG 基因起源与进化的学术论文（如下面的三篇论文），讨论PTC 基因的功能以及该基因的起源与进化。1 Fisher,R.A.,Ford,E

24、.B.&Huxley,J.(1939).Taste-testing the anthropoid apes.Nature,144,750.2 Wooding,S.,Kim,U.,Bamshad,M.J.,Larsen,J.,Jorde,L.B.&Drayna,D.(2004).Natural selection and molecular evolution in PTC,a bitter-taste receptor gene.American Journal of Human Genetics,74,637-646.3 Wooding,S.,Bufe,B.,Grassi,C.,Howard

25、,M.T.,Stone,A.C.,Vazquez,M.,Dunn,D.M.,Meyerhof,W.,Weiss,R.B.&Bamshad,M.J.(2006).Independent evolution ofbitter-taste sensitivity in humans and chimpanzees.Nature,440,930-934.7.参考文献：1 http:/openwetware.org/wiki/BISC110/F09:Series22 Merritt RB,Bierwert LA,Slatko B,Weiner MP,Ingram J,Sciarra K,Weiner E.Tasting phenylthiocarbamide(PTC):a new integrative genetics lab with an old flavor.The American Biology Teacher,2008,70(5):23-28,谢谢,