细胞原代培养与传代.ppt

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1、目录,细胞培养基本概念细胞培养基本要求细胞培养基本技术,细胞培养定义,定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。,细胞培养的基本概念,

2、传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,接触抑制（Contact inhibition）,细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。,体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。,细胞传代次数（Pass

3、age Number）,原代培养（primaryculture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。,克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,细胞系（cellline）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖,细胞株（cellstrain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,原代培养与细胞系,原代培养细胞的生命归宿,原代培养期传代期衰退期,The Amer

4、ican Type Culture Collection(ATCC)The European Collection of Animal Cell Culture(ECACC)National Institute of Health(NIH),USA National Cancer Institute(NCI),USA,细胞系资源,有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line细胞株 cell strain,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,每代贴附生长

5、细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为624小时。,对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合

6、进行实验研究。,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性,二、细胞培养基本要求,常用仪器设备培养器皿培养基血清其他细胞培养试剂,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要2 细胞的生存环境 温度:37 O2 CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-渗透压 3 无污染 4 无毒,常用仪器设备,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃

7、器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14 h)。箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿

8、度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,Culture flask,Culture Plate,培养器皿,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,常用玻璃器皿清洗,清洁液的配制,细胞培养基,干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F12等,培养基的选择

9、,没有一定的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,血清使用注意事项,血清必须贮存于20-70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。血清解冻步骤(逐步解冻法)

10、:-20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活（heat-inactivation）是指56,30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质,凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因

11、是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm,5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响

12、细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。,血清沉淀物,如何避免沉淀物的产生?,解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉

13、淀物的增多。,谷氨酰胺,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为1-4mM一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L）配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM,酚

14、红,大多数培养液中使用酚红作为pH 指示红色表示中性pH黄色代表酸性pH紫色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,细胞培养用液的配制,抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方

15、便、广谱、稳定,完全培养基的组成,基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升,培养基的配制,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）,细胞消化液,分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA4Na 溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，

16、使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长,三、细胞培养基本技术,细胞原代培养 细胞换液与传代细胞冻存与复苏,鼠胎组织细胞原代培养,取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

17、静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清消化、接种培养：加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入510ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养,换液：全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄，。细胞状态,细胞换液,细胞传代,原代细胞传代以便获得稳定的细胞株细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续接触抑制营养枯竭将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的器皿

18、中进行培养，即为传代培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增36次,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法：,1.吸

19、光培养瓶中的培养液2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。6.将后者放入培养箱中培养。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不

20、致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,细胞冻存,冷冻保存要点冷冻过程要缓慢：4 3060 分钟-20 30 分钟-80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存或使用程序降温盒，每秒下降1 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：5x1062x107/ml。常用细胞冷冻保存液5%或10DMSO完全培养液10甘油完全培养液,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，

21、降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4 年后，存活率可达80一90。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞复苏,快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培

22、养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中,收到细胞的处理方式(一),1.收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于70 C，隔夜后，移到液氮)。2.冷冻细胞解冻程序:2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基

23、组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。2.2.FBS(fetal bovine serum,胚牛血清),CS(calf serum,小牛血清)和HS(horse serum,马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。,2.3.将培养基置于37 C 水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，以70%ethanol 擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加

24、至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入37 C，5%CO2 培养箱培养。2.5.对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5-10 ml 培养基中，离心300 xg(约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37 C，5%CO2 培养

25、箱培养。,收到细胞的处理方式(二),收到T25 flask 细胞时，处理方式为 1.于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2.将原封之T25 flask 静置于37 C，5%CO2 培养箱中，使细胞回温至37 C，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培

26、养。,【注意事项】,1本实验自始至终要严格进行无菌操作，不能抱有任何侥幸心理，器皿和器械一旦有污染的可能，要勤换或在酒精灯上勤烧烤。配液时所使用的三角瓶瓶口、吸管等都要注意在酒精灯上烧烤。2配制液体调试pH值时，要少量多次加入NaHC03，以免过量偏碱造成不必要的液体浪费。3待细胞分装到培养瓶后，要在瓶壁的上面做好标记，以便区分细胞的贴壁面，严防在细胞换液时培养液未覆盖到细胞面上，造成细胞干枯死亡。4实验操作前，净化台或无菌室要进行紫外灯照射消毒20分钟。5实验所用物品，要求全部进行无菌处理。6培养过程中要随时注意培养箱的温度，严格控制在37 0.5。7在细胞培养操作过程中，严禁说话。8培养细胞的冻存和复苏的全部过程，必须在无菌橱中和酒精灯上进行操作，否则容易发生污染，影响冻存质量，复苏后则不易成活。冻存的细胞在复苏时必须尽快融化，使之迅速通过细胞最易受损伤的-50，以防止冰晶的损伤。同时因冻存液中的DMSO对细胞有毒性作用，所以操作必须迅速。,