培养基和试剂质量控制方法.ppt

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1、培养基和试剂质量控制方法GB 4789.28-201X,北京陆桥技术有限责任公司 技术服务电话：0532-82689263 技术部邮箱：销售服务电话：0532-82689263,主要内容,1、培养基简介,培养基 液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖（含或不含某类微生物的抑菌剂）、鉴定或保持其活力的物质。,1.1 定义,1、培养基简介,1.2.1 按组成成分分类1.2.2 按状态分类1.2.3 按用途分类1.2.4 按制备方法分类,1.2 分类,1、培养基简介,1.2.1 按组成成分分类纯化学培养基：仅含有已知分子结构和纯度的化学成分的培养基。未定义和部分定义的化学培养

2、基：全部或部分由天然物质，加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基。,1、培养基简介,1.2.2 按状态分类液体培养基：一种或多种成分组成的水溶液。如：脑心浸出液肉汤、营养肉汤；半固体培养基和固体培养基：含一定量固化物（琼脂、明胶等）的液体培养基。半固体培养基：含0.2%-0.8%琼脂粉，多用于细菌的动力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料等。固体培养基：含1.5%-2%琼脂，多用于细菌的分离、鉴定、菌种保存,1.2.3 按用途分类,1.2.4 按制备方法分类即用型培养基：以即用形式或融化后即用形式置于容器内供应的液体、半固体和固体培养基脱水合成培养基：使用前需加水和进行处理的干燥培养基自

3、制培养基：依据完整配方的具体成份配制的培养基,1、培养基简介,2、培养基质量保证,质量保证培养基生产企业提供文件,标明培养基各种成分、添加成分名称及产品编号；批号培养基最终pH值储藏信息和有效期质控证书和测试菌株性能测定结果及验收标准必要的安全和/或危害数据,质量保证培养基使用者,每批培养基，应验收：产品合格证明包装的完整性产品的有效期生产企业文件的提供记录接受日期,2、培养基质量保证,2.1 脱水合成培养基制备流程,2.2脱水合成培养基制备注意事项概述：严格按照厂商提供的使用说明配置。水：实验用水的电导率在25时不应超过25S/cm，相当于电阻率0.4Mcm。微生物污染103/mL，最好在1

4、02/mL以下；定期检查实验用水是否受到微生物污染。,2、培养基质量保证,2、培养基质量保证,2.2脱水合成培养基制备注意事项 pH值测定和调整：使用pH计测定；灭菌后冷却至25时测定pH值；pH值应在标准pH0.2范围内；使用1mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液调整培养基的pH值。（如需灭菌后调整pH值，则使用灭菌溶液）,2、培养基质量保证,灭菌方式：湿热灭菌；煮沸灭菌；过滤除菌：注意避免过度加热：1.大容积（1000mL)时容易过度加热；2.放置物品太多或灭菌后未及时冷却。,2.2脱水合成培养基制备注意事项,SC正常加热 SC过度加热,2.3脱水合成培养基使用注意事项 灭菌或复溶后培养基放入4

5、7-50的恒温水浴锅中，冷却保温，直至使用；培养基只可复融一次，融化后的培养基应尽快使用，放置时间不应超过4小时，未使用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。个别培养基使用前需要脱氧：松开容器盖子，沸水浴或蒸气浴中加热15min，盖紧盖子，迅速冷却，如 FT培养基。,2、培养基质量保证,2、培养基质量保证,2.4菌株定义标准菌株：至少定义到属或种水平的菌株，按菌株特性进行分类和描述，官方菌种保藏机构获得，最好来源于食品或水；标准储备菌株：将实验室获得或供应商提供的标准菌株转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株；储备菌株：从标准储备菌株转接第一代的培养物；工作菌株：由标准储备菌株或储备菌株，或由经

6、证明或未证明的标准物质转接一代获得的菌株,指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种，经证明的标准物是指其浓度已经证明。,2、培养基质量保证,标准/质控菌株主要来源美国菌种保藏中心American Type Culture Collection Center,ATCC（英国）国家菌种保藏中心(UK)National Center for Typical Culture Collection,NCTC中国工业微生物菌种保藏管理中心China Center for Industrial Culture Collection,CICC中国医学微生物菌种保藏中心China Center for Med

7、ical Culture Collection,CMCC注：陆桥均可代购以上菌株,ATCC菌株（进口）,CMCC菌株（国产）,注：ATCC菌株提供证书，可以自行到其网站下载。,2、培养基质量保证,2、培养基质量保证,标准菌株(冻干菌种）转种活化标准储备菌株（-80冰箱保存的培养物）转种活化储备菌株（4冰箱保存的培养物）转种活化工作菌株（用于培养基微生物质控的新鲜培养物）,详细请参考附录C,通常悬浮于营养肉汤中适宜时间进行复苏,验证菌落形态和革兰氏染色或用生化试验进行鉴定,例如：TSB添加10%-15%甘油作为冷冻保护培养基,在不高于-70低温冷冻保存可延长保存的时间。禁止采用较高的温度保存。,

8、此流程更合适,3、培养基质量要求,基本(感官和理化)要求：,分装的量和/或厚度外观、色泽和均一性琼脂凝胶的硬度水分含量20-25 的pH值缓冲能力,微生物要求：,微生物污染测试（只适用于即用型培养基）生长特性 1、生长率 2、选择性 3、特异性 4、抗菌试验特性注：详细参照GB 4789.28附录F培养基质量控制标准,性能评价和结果解释：1、所有测试菌株的性能测试达到标准，则该批培养基的性能测试结果符合规定；2、基本要求和微生物要求均符合规定，则该批培养基可被接受。,质构仪,水分测定仪,电极式pH计,3、培养基质量要求,3、培养基质量要求,生长特性概述 a）定量方法；b）半定量方法；c）定性方

9、法。注：使用以上方法时，应使用参考培养基进行对照，有助于结果的解释。,选择近期批次中质量良好的，或具有长期稳定性的批次培养基或即用型培养基,通常可满足实验室的培养基性能检测要求,培养基生产商自制培养基新培养基或新供应商产品其他特殊要求,培养基性能测试第一法,4、培养基性能测试方法,4.1定量方法,悬浮培养基和运输培养基,非选择性固体分离和计数培养基,选择性固体分离和计数培养基,选择性固体分离和计数培养基,4.2半定量方法,选择性液体增菌培养基,非选择性液体增菌培养基,选择性液体计数培养基,非选择性固体分离和计数培养基,4、培养基性能测试方法,选择性固体分离和计数培养基,4.3定性方法,Muel

10、ler Hinton血琼脂,鉴定培养基和实验试剂,悬浮培养基和运输培养基,非选择性固体分离和计数培养基,非选择性液体增菌培养基,选择性液体计数培养基,选择性液体增菌培养基,将适当稀释度的目标菌0.1mL分别涂布于待测培养基平板和参考培养基平板（可用螺旋平板法或倾注法），经培养后，计算PR。PR=NS/NO PR：生长率；NS：待测培养基平板上得到的菌落总数；NO：参考培养基平板上获得的菌落总数，应100CFU。结果解释：非选择性培养基和选择性计数培养基上目标菌的生长率应不小于0.7；选择性分离培养基上目标菌的生长一般不小于0.5，最低应为0.1。,接种水平为20CFU200CFU,4.1 定量

11、方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,4、培养基性能测试方法,例：木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）测试菌株：鼠伤寒沙门氏菌，福氏志贺氏菌；10倍稀释，选取适宜稀释度0.1mL涂布XLD平板和TSA参比平板，361培养 18h24h；计数：,鼠伤寒沙门氏菌：,福氏志贺氏菌：,4.1 定量方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,4、培养基性能测试方法,待测培养基分装试管，10mL/支（或5mL/支）；目标菌浓度选择：100CFU1000CFU；接种后，混匀：立即吸取1mL，用相应培养基倾注平板；剩余已接菌的待测培养基置2025放置45min，再吸取1mL用相应培养基倾注平板；分别按标准方

12、法中规定的培养条件培养后，计数；结果观察与解释：待测培养基中的菌落数变化应在50%内。,4、培养基性能测试方法,4.1 定量方法 悬浮培养基和运输培养基,制备106108CFU/mL 的工作菌悬液；用1L接种环划线平板，A区用按0.5cm的间隔划四条平行线，按同样方法在B、C区划线，最后在D区划一条连续曲线；培养后，评价菌落的形状、大小和生长密度，计算生长指数G；每条有菌生长的划线记为1分，如果仅一半的线有菌生长，记为0.5分，没有生长或生长量少于划线一半的，记为0分；结果解释：目标菌在培养基上应呈典型的生长，目标菌生长指数G大于6，培养基可接受；非选择培养基的G值通常较高。,4、培养基性能测

13、试方法,4.2 半定量方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,非目标菌半定量测试方法用1L接种环划线平板，划六条平行直线；每条有菌生长的划线记为1分，如果仅一半的线有菌生长，记为0.5分，没有生长或生长量少于划线一半的，记为0分；结果解释 非目标菌的生长应部分或完全被抑制。,注：操作时用接种环而不用接种针，接种环完全浸入培养基中，取一满环接种物，接触容器边缘3次，去除多余液体。划线时，接种环与琼脂表面的角度应为20-30，接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。,4、培养基性能测试方法,4.2 半定

14、量方法 选择性固体计数和分离培养基,培养基分装，10mL/支；新鲜菌液10倍稀释后，选取10CFU100CFU稀释度工作菌悬液；取1mL工作菌悬液接入待测培养基；同时取1mL倾注平板，做接种量计数用；按标准方法中的培养时间和温度进行培养（如增菌时间为8h以下，取10L增菌液倾注平板，再按适合的时间和温度培养，结果按附录F判定）；结果解释：0 表示无混浊；1 表示很轻微的混浊；2 表示严重的混浊目标菌的浊度值应为2.,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 非选择性液体增菌培养基,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 非选择性液体增菌培养基,混合菌接种：同时分别将目标菌菌悬液（与待测培

15、养基接种同一稀释度）和非目标菌菌悬液（比待测培养基接种小10100倍稀释度）1mL倾注平板，用作接种量计数 非目标菌接种：在待测培养基中接种等量混合菌试管中的非目标菌。培养液接种：混合菌培养液接种：用10L接种环取1环培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的选择性平板上；非目标菌培养液接种：吸取10L培养后的非目标菌培养液，涂布到非选择性平板上；计算和结果解释 目标菌在选择性平板上的菌落应10CFU 非目标菌在非选择性平板上的菌落数应100CFU,则表示待测液体培养基的生长率良好,4.2 半定量方法 选择性液体增菌培养基,4、培养基性能测试方法,例：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）目标菌株：鼠伤寒沙

16、门氏菌(10CFU100CFU)；非目标菌：大肠埃希氏菌(1000CFU5000CFU)铜绿假单胞菌(1000CFU5000CFU);混合接种：混合菌1mL接种待测培养基；分别将鼠伤寒沙门氏菌（10CFU100CFU）和大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌（小10100倍稀释度）1mL倾注平板，用于计数；非目标菌接种：在待测培养基中接种等量混合菌试管中的非目标菌。,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 选择性液体增菌培养基,4.2 半定量方法 选择性液体增菌培养基,4、培养基性能测试方法,例：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）混合菌培养液的接种：用10L接种环取1环培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的

17、选择性平板上；非目标菌培养液接种：吸取10L培养后的非目标菌培养液，涂布到非选择性平板上；计算和结果解释 鼠伤寒沙门氏菌的菌落应10CFU 大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌在非选择性平板上的菌落数应100CFU,目标菌接种：取1mL目标菌（10CFU100CFU稀释度）接种待测培养基，同时取1mL倾注平板，用作接种量计数；非目标菌接种：取1mL非目标菌（1000CFU5000CFU稀释度）接种待测培养基，同时取1mL（比待测培养基接种小10100倍稀释度）倾注平板，用作接种量计数；结果解释：0 表示无混浊；1 表示很轻微的混浊；2 表示严重的混浊。如需观察产气，记录小导管收集气体的体积比。目标菌的浊

18、度值应为2，产气应为1/3或以上；非目标菌的浊度值应为0或1，无产气现象。,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 选择性液体计数培养基,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 选择性液体计数培养基,用1L接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线（细菌），或用接种针直接挑取斜面培养物点种接种（霉菌），按标准规定的培养条件培养。结果解释 0 表示无生长；1 表示微弱生长；2 表示生长良好。目标菌：得分为2，有典型的菌落外观、大小和形态；非目标菌（选择性）：得分为0或1；非目标菌（特异性）：有典型的菌落外观、大小和形态。,4.3 定性方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,4、培

19、养基性能测试方法,用1L接种环取工作菌悬液，接种到待测液体培养基中，培养。结果解释：0 表示无混浊；1 表示很轻微混浊；2 表示严重混浊。目标菌：浊度值为2；非目标菌：浊度值为0或1；,注：有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振荡试管后再进行观察。,4、培养基性能测试方法,4.3 定性方法 非选择性、选择性液体增菌和计数培养基,用1L接种环取一环工作菌悬液直接接种到待测培养基中，混匀，立即用10L接种环取一环划平行线接种平板；剩余已接种菌液的待测培养基置2025放置45min，再用10L接种环取一环划平行线接种平板；按标准方法中规定的培养条件培养。

20、结果观察与解释 前后平板上目标菌的生长情况应均为良好。,4.3 定性方法 悬浮培养基和运输培养基,4、培养基性能测试方法,纸片扩散法（定性测试）平板制备：倾注平板，厚度为4mm5mm，使用前适当干燥；质控菌：接种在血平板上复苏，纯度满意后，用于工作菌悬液制备；工作菌悬液：指控菌株悬浮与TSB肉汤中，浊度为0.5麦氏标准（约1108CFU/mL2108CFU/mL）；接种：将工作菌悬液涂布与待测的MH平板上，贴上相应的抗生素纸片（每皿最多6片），平板翻转后培养。注：调整菌悬液浊度与接种所有平板的时间不要超过15min。结果观察与解释 在无反射黑色背景下，观察有无抑菌环。结果解释参照附录F培养基质

21、量控制标准。,4.3 定性方法Mueller-Hinton血琼脂,4、培养基性能测试方法,4.3.1 液体培养基 制备5McFrand浊度（约为109CFU/mL）的菌悬液；接种：吸取0.05mL0.08mL（约12滴）至待测培养基内；按标准方法中规定的培养条件培养。结果观察与解释 需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，在观察结果。例：尿素培养基+：阳性，奇异变形杆菌，培养基变玫红色；：阴性，大肠埃希氏菌，培养基变黄色或不变色,blank+,4.3 定性方法鉴定培养基,4、培养基性能测试方法,4.3.2 半固体培养基用接种针条取新鲜质控菌株，穿刺接种待测培养基内；按标准方

22、法中规定的培养条件进行培养；结果观察与解释 需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，在观察结果。例：半固体培养基+：阳性，单增李斯特氏菌，呈伞状或月牙状生长；：阴性，蜡样芽孢杆菌，沿穿刺线生长。,+,4、培养基性能测试方法,4.3 定性方法鉴定培养基,4.3.3 高层斜面培养基和斜面培养基高层斜面（斜面与底层高约为：2:3）；普通斜面（斜面与底层高约为：3:2）；接种：高层斜面：用接种针挑取新鲜质控菌株穿刺接种值琼脂高层，再在斜面上划“之”字形；普通斜面：用接种针挑取新鲜质控菌株在斜面上划“之”字形；结果观察与解释 需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂

23、，在观察结果。,4、培养基性能测试方法,4.3 定性方法鉴定培养基,例：三糖铁琼脂灭菌后制成高层斜面备用空白对照（左一）：橘红色,4、培养基性能测试方法,4.3 定性方法鉴定培养基,实验室试剂 1、按照试剂说明书进行实验；2、参照标准进行结果观察与解释。,4、培养基性能测试方法,5、测试结果的记录,制造商信息：培养基制造商或供应商应按客户的要求提供培养基常规信息和相关测试菌株生长特性信息。溯源性:按照质量体系的要求，对所有培养基性能测试的数据归档，并在有效期内进行适当的保存。建议使用内部质量控制单进行文件记录并评价测试结果。,产品质量检验报告,产品 MSDS,5、测试结果的记录,5、测试结果的

24、记录,用于产品内部质量控制的评价测试结果和产品信息。,1、培养基不能凝固 制备过程中过度加热；低pH值造成培养基酸解；称量不正确；琼脂未完全溶解；培养基成分未充分混匀。,培养基常见问题,2、pH值不正确 制备过程中过度加热；水质不佳；外部化学物质污染；测定pH值时温度不正确；pH计未正确校准；脱水培养基质量差.,培养基常见问题,3、颜色异常 制备过程中过度加热；水质不佳；pH不正确；外来污染；脱水培养基质量差。,培养基常见问题,4、产生沉淀 制备过程中过度加热；水质不佳；脱水培养基 质量差；pH值未正确控制；原料中的杂质。,培养基常见问题,5、培养基出现抑制/低的生长率制备过程中过度加热；脱水

25、培养基质量差；水质不佳；使用成分不正确，如：成分称量不准，添加剂浓度不正确；制备容器或水中的有毒残留物。,培养基常见问题,6、选择性差制备过程中过度加热；脱水培养基质量差；配方使用不对；添加成分的加入不正确；例：加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误；添加剂污染。,培养基常见问题,7、污染 不适当的灭菌；无菌操作技术存在问题；添加剂污染。,培养基常见问题,培养基常见问题,8、容器洁净度新购置的玻璃器皿应先在酸溶液内浸泡数小时使用过的器皿在清洗时要注意不能有洗涤剂和自来水的残留如果容器不洁净或有残留，可能导致培养基出现异常沉淀、微生物生长异常，也可能影响荧光现象的观察,培养基常见问题,9、配制培

26、养基用水的要求,培养基常见问题,10、含琼脂培养基水浴及复溶的要求,水浴时间不宜超过4h 如果不能在4h内及时使用，应迅速冷却，使其凝固，使用前再进行复溶 但不可多次复溶，否则会影响培养基的pH值，并导致凝胶强度下降,11、常用加热煮沸方式直接用电炉加热：耗时，含琼脂培养基容易烧糊隔水煮沸的弊端a温度不够，达不到灭菌效果b经隔水煮沸的含琼脂培养基，在水浴的过程中易出现分层现象为您提供一种快速便捷的方式 第一步：采用微波炉适当加热 第二步：在电炉上继续加热至沸腾,培养基常见问题,培养基常见问题,12、灭菌过程对培养基质量的影响如果没有达到设定的灭菌条件可能引发的问题：培养基pH异常、颜色不均、灭

27、菌效果不彻底常用监测方法 化学指示卡：使用方便，高压后可立即得知监测结果 生物指示剂：准确性高,培养基常见问题,13、导致颜色差异的原因干粉颜色差异正常差异：由指示剂的批间差异造成的、在允许范围内的颜色差异产品变质：如SC增菌液干粉变红，说明亚硒酸盐已被氧化，不能使用溶液及平板颜色差异正常差异：指示剂的批间差异造成的；某些含有酸碱指示剂的培养基，其pH值是一个范围，在这个范围内，颜色略有差异也是正常现象异常情况：pH值异常导致的，可能是培养基或配制用水的pH值异常；高压灭菌过程对颜色产生了影响,培养基常见问题,14、培养基保存的注意事项培养基的保存条件：避光保存于阴凉干燥处，使用后，拧紧瓶盖，避免吸潮、氧化或污染。干粉保质期：一般未开封的培养基可保质年，已开封的可保质半年。建议在瓶体注明开封日期。个别品种的特殊保存要求：SC增菌液，建议开封后冷藏保存，可延长保质期,THANK YOU!,