肿瘤病理研究新热点及新技术.ppt

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1、肿瘤病理新热点及新技术New Hot Spots and New Techniques of Tumor Pathology 冯德云,20世纪20-50年代，是化学致癌研究最迅猛的时代;60-70年代的掀起寻找癌症病毒狂潮;70-80年代是癌基因疯狂时代;80年代末进入迷恋抑癌基因时代;90年代细胞周期、信号转导和细胞凋亡理论在癌症研究中的广泛运用。然而，浪潮很快过去了，因为这些都被证明与癌症有关，但不是癌症的本质！,人类在肿瘤研究方面经历了一个又一个浪潮,肿瘤研究的新热点,肿瘤干细胞microRNAEMT,肿瘤干细胞 Tumor Stem Cell,干细胞(Stem Cell),是一种未充分

2、分化，尚不成熟的细胞，是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。,干细胞分类方法,一是根据干细胞所处的发育阶段分为：胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(somatic stem cell)。二是根据干细胞的发育潜能分为：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)多能干细胞（pluripotent stem cell）单能干细胞（unipotent stem cell）诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。,胚胎干细胞的

3、发育等级较高，是全能干细胞，具有分化为几乎全部组织和器官的能力。而成体干细胞的发育等级较低，是多能或单能干细胞。成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能。,肿瘤干细胞,2006年American Association for Cancer Research 的定义是：肿瘤中具有自我更新能力、并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。,1.概念的提出,传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。肿瘤

4、细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞(tumor stem cell，TSC)的理论。,这一理论为我们重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和新的视觉角度。,2.实验依据,从20世纪50年代Southam C等进行的肿瘤细胞自体/异体移植实验、到后来众多实验都证实并非每个肿瘤细胞都具有再生肿瘤的能力，只有一小部分肿瘤细胞在体外克隆形成实验中可以形成克隆，在异种移植模型中，只有移植人大量的肿瘤细胞才能形成移植瘤，究竟何种细胞行使肿瘤起源细胞(tumor-initiating cell，TIC)的功能?,随机化理论 认为肿瘤细胞具有同质

5、性，即每一个肿瘤细胞都具有新生肿瘤的潜力，但是能进入细胞分化周期的肿瘤细胞很少，是一个小概率随机事件。分层理论 认为肿瘤细胞具有功能异质性，只有有限数目的肿瘤细胞具有产生肿瘤的能力，但这些肿瘤细胞再生肿瘤是高频事件。,3.两种理论解释,目前的实验结果,倾向于第二种解释，即肿瘤组织中存在数量稀少的癌细胞，在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潜能，虽然数量少，却在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用。,由于其众多性质与干细胞相似，所以这些细胞被称为肿瘤干细胞，肿瘤干细胞能不对称产生两种异质的细胞，一种是与之性质相同的肿瘤干细胞，另一种是组成肿瘤大部分的非致瘤癌细胞。,

6、TSC与成体干细胞关系,肿瘤细胞突变最早发生于干细胞 干细胞与TSC具有无限增殖相似的生物学特性,只需突变获得过度增殖能力,就可以转化成为肿瘤；干细胞比分化细胞周期性更新快,寿命长，突变更容易累积。干细胞是突变的靶点。,表面标记表明TSC来源于成体干细胞 由于造血干细胞研究进展，白血病干细胞的分离和表面标记测定较早开始。目前研究发现，几乎所有白血病干细胞与造血干细胞一致，均为CD34+，如所有的急性单核细胞性白血病（除急性早幼粒细胞性白血病）干细胞都为CD34+,CD38-。,目前研究较多的TSC标记物,CD34，CD133，CD44，前列腺干细胞抗原（PSCA），干细胞抗原2（Stem Ce

7、ll Antigen 2），CD90，OV-6，Oct-4 等。,ICC中CD133表达,ICC中CD44表达,ICC中PSCA表达,Bmi1基因参与正常造血过程，其功能障碍与AML有关。Bmi1基因敲除的小鼠干细胞移植入免疫力摧毁的小鼠，干细胞可以短期产生血细胞，8周后，移植细胞基本消失。说明Bmi1基因对正常血液干细胞的自我更新是必要的。,成体干细胞、TSC与Bmi1基因,Bmi1基因对白血病细胞的产生也是必要的。将Meis1a和Hoxa9癌基因导入小鼠骨髓细胞可以产生AML模型。把Meis1a和Hoxa9癌基因导入正常小鼠与BMi1基因失活小鼠，都可以产生白血病细胞。但是Bmi1基因失活

8、小鼠的白血病细胞移植入免疫缺陷小鼠后不能再产生白血病细胞。所以，Bmi1基因对白血病干细胞的自我更新和维持都是必要的。,Wnt、SHH(sonichedgehog)、Notch途径调控干细胞与TSC的生长分化，提示机体一生中细胞的生长分化由相似的生长调控机制调节,其异常可引起细胞过度增殖，导致肿瘤。,干细胞与TSC有相似的生长调控机制,TSC与干细胞有相同的起源,侧脑室室管膜下层与海马齿状回是神经干细胞的起源地。通过神经祖细胞与其他祖细胞的癌基因与p53抑癌基因突变，可以制造小鼠脑肿瘤模型。这些模型小鼠产生不同的脑肿瘤。影象学研究表明，这些脑肿瘤虽然可以在广泛的脑内区域产生，但这些肿瘤都起源于

9、侧脑室与海马。,肿瘤干细胞是恶性肿瘤的起源，又是恶性肿瘤治疗的靶点，因此，肿瘤干细胞的研究已成为当前肿瘤研究的热点，也是创新研究的前沿。,肿瘤早期诊断 因为肿瘤干细胞是肿瘤发生过程中的最原始细胞，如果可以及早地识别并分离出肿瘤干细胞，就有可能依据其分子标志来对患者进行早期诊断。肿瘤干细胞具有能自我更新、增殖的特征，因此对其增殖功能的检测可能成为肿瘤最早期诊断的标准。,肿瘤干细胞研究价值巨大,阐明肿瘤干细胞增殖过程中的基因调控机理，将为抗肿瘤药物的研发提供新的理论基础，针对肿瘤干细胞的新一代抗肿瘤药物，有望极大地提高肿瘤的治疗效果。,为研发新一代高效的抗肿瘤药物提供新的靶点,由于肿瘤干细胞与肿瘤

10、细胞具有异质性，其生物学特性和对治疗手段的敏感程度也并不完全一致。传统的治疗手段针对的是大多数的肿瘤细胞，往往忽视了占少数的肿瘤干细胞，因而对肿瘤干细胞无法达到最有效的杀灭效果。,肿瘤治疗应该针对肿瘤干细胞的生物学特性制订治疗方案。,肿瘤干细胞的发现有可能彻底改变现有化疗药物的选择配伍、有效剂量和疗程，以彻底消灭肿瘤干细胞为指标的新化疗方案有望极大地降低癌症的复发率和提高其治愈率。,1.肿瘤干细胞是如何产生的？虽然一些肿瘤干细胞的存在已经得到了实验性证实，如白血病、乳腺癌，肝癌，但是否所有的肿瘤都起源于肿瘤干细胞还不清楚。2.如何识别和分离肿瘤干细胞？这是利用肿瘤干细胞来进行癌症治疗的一个关键

11、环节。根据细胞表面标记的特征，科研人员已经识别和分离出几种肿瘤干细胞，如何对其他肿瘤的干细胞进行分子或者形态上的鉴定，仍然是一项非常艰巨的任务。,“三大难关”需要攻克,3.如何避免杀伤正常干细胞？由于肿瘤干细胞与干细胞的相似性，如何避免对肿瘤干细胞具有杀伤作用的治疗手段影响到正常的干细胞就显得十分重要。如果采用的治疗手段不适，就有可能引发严重的副作用，使人类正常的干细胞受到损害。,诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells),定义,通过特定的基因组合与转染可以将已分化的体细胞诱导重编程为的多潜能干细胞。,2006年,日本Yamanaka研

12、究小组通过将逆转录病毒介导的Oct-4,Sox2,Klf4及c-Myc四个基因转入鼠成纤维母细胞,将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞,并将该类干细胞命名为iPS细胞。2007年,美国Thomson 实验室报道了Oct-4,Sox2，Nanog及Lin28四个基因的转染可将人成纤维母细胞重编程为iPS细胞。,这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态,因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。,iPS细胞体内外的诱导分化,与人和鼠的ES 细胞一样，iPS细胞植于免疫缺陷鼠皮下可在注射部位形成由内、中和外胚层来源细胞杂乱排列构成的畸胎瘤。将小鼠iPS

13、细胞注射入小鼠囊胚，其可与受体细胞一起发育形成包括生殖系在内的各种组织而形成嵌合体。通过嵌合体技术或四倍体胚胎补偿法(tetraploid complementation)亦可获得完全由小鼠iPS细胞发育而来的个体。,iPS细胞在一定培养条件下在体外可分化成含三个胚层来源细胞的多细胞结构，在其内可检测到：外胚层细胞如-tubulin 阳性神经元、Tuj1阳性的神经元、Nestin 阳性细胞和星形胶质细胞中胚层细胞如CD34阳性细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞内胚层细胞如AFP(alpha-fetoprotein)阳性细胞以及TROMA-阳性的细胞等。,研究者已成功地将iPS细胞

14、在体外定向诱导分化为神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，如运动神经元和多巴胺能神经元、星形胶质细胞、造血前体细胞、造血细胞、胰腺细胞和肝细胞、分泌胰岛素的细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、胰腺细胞等。,应用及意义,iPS细胞在形态学、表观遗传学、全基因表达谱以及细胞类型特异的分化潜能方面与ES细胞极其相似，并且个体特异来源的iPS细胞尚不涉及免疫排斥问题，所以iPS具备成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞。,为建立“个体特异的”、“病人特异的”或“疾病特异的”人iPS 细胞和实现“个体化的”药物药效与ADME/Tox评价等奠定了良好基础。“病人特异的”或“疾病特异的”人iPS

15、 细胞也可以用来研究特定疾病(如人ALS)的发病机制。,Micro RNA,近年来，国际分子生物学顶尖级杂志CNS(Cell/Nature/Scicence)，连续把RNA的研究进展列为“十大科技突破之一”，其中最引人注目的当是microRNA。,(一)miRNA的概念 miRNA是一类长度约为22nt的小分子非编码单链RNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体（pre-miRNA）加工而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3末端非翻译区(3untranslationalregion,3UTR)结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。,（二）miRNA与siRNA的区别-特

16、性 miRNA siRNA-来源 内源转录本 转基因、病毒RNA 大小 约22nt 约22nt 前体 茎环状的pre-miRNA 双链结构的dsRNA 催化酶 Drosha、Dicer或类似 Dicer Dicer的酶复合体 RISC复合体 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族 匹配方式 不完全互补（动物）或 完全互补 完全互补（大多数植物）作用专一性 相对较低 高 作用点 蛋白质合成水平 转录后水平 靶基因的命运 抑制转录或者被降解 被降解 功能 发育过程中调节 抑制转录活性、病毒 内源基因的表达 感染、表型遗传-,（三）miRNA 的功能及意义 高等真核细胞中，miR

17、NA基因占已知基因的1%，目前估计哺乳动物细胞中有600多个miRNA，30%的基因要受到miRNA的调节。miRNA的多样性与进化保守性决定了其在生理生化功能上的重要性与普遍性。然而只有少数miRNA的已经明确，许多miRNA的功能还尚待深入研究。,已知功能的miRNA-miRNA名称 物种 生物学功能 靶基因-lin-4 线虫 发育时序调节 lin-14,lin-28let-7 线虫 发育时序调节 lin-41,hbl-1lsy-6 线虫 神经细胞化学感受器 cog-1 不对称性调节miR-273 线虫 神经细胞化学感受器 die-1 不对称性调节miR-165/166 拟南芥 叶子近轴与

18、离轴细胞的分化 PHV/PHBmiR-172 拟南芥 花朵发育 APETALA2(AP2)Bantam 果蝇 调节细胞增殖和凋亡 hidmiR-14 果蝇 调节细胞凋亡和脂类代谢 caspase Ice?miR-15a/哺乳动物 B细胞慢性淋巴细胞白血病 Bcl-2miR-16-1（B-CLLs）miR-196 哺乳动物 脊椎动物发育 Hox-B8miR-143 哺乳动物 脂肪细胞分化 erk5miR-375 哺乳动物 胰岛素分泌调节 mtpn miR-1 哺乳动物 心脏细胞的生长和分化 Hand2-,1.miRNA与生物体的发育、与细胞分化、与细胞增殖和调亡、与激素分泌 等功能有关。,2.m

19、iRNA与肿瘤发生及治疗 近几年，miRNAs与人类肿瘤的关系逐渐引起了人们的广泛注意，并不断有肿瘤发生与miRNAs的表达有关的例子的报道。研究表明，miRNA的表达水平在许多肿瘤中发生改变，它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。,（1）Calin 等发现 miR-15a和 miR-16-1定位于染色体 13q14,而这一区域在一半以上的 B-CLLs 病人中缺失。而且这一缺失在约50%的外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL),16%40%的多发性骨髓瘤和60%的前列腺癌中出现。推测他们可能起着肿瘤抑制基因的角色。（2）Iorio和Michael等发现，miR-1

20、43，miR-145在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和淋巴瘤中的表达下调，这两个基因位于 5q32-33。（3）He等研究发现，miR-221,-222,-146在乳头状甲状腺癌中显著上调。,（4）CiafreSA和Chan 等发现，miR-21 可作为一种抗凋亡因子，在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。（5）Metzler等在儿童的Burkitt淋巴瘤中发现 miR-155/BIC 的前体高表达。（6）JohnsonSM 等发现肺癌let-7的表达常是降低的，let-7的靶点是Ras癌基因，RAS 信号通路在哺乳动物中调控细胞的正常生长和恶性增殖,RAS 蛋白过表达会引起细胞的恶性增殖

21、，let-7表达的降低可致其靶点癌基因Ras表达的增加和促进肿瘤生长。,microRNA可能是肿瘤治疗的神奇子弹,在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中研究发现，miR-15a和miR-16-1存在缺失或下调，miR-15a和miR-16-1的表达与CLL中Bcl2的表达相反，这两个microRNA在转录后的水平上对Bcl-2起负调节作用。在白血病细胞系中已经观察到，含有9 bp Bcl-2互补序列的miR-15a和miR-16-1，通过抑制Bcl-2蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。miR-15a和miR-16-1是Bcl-2天然的反义作用因子，可以用于治疗Bcl-2过表达的肿瘤。,3.miRNA功能研

22、究 寻找下游靶基因是发现miRNA功能的一个直接手段。由于miRNA与靶基因的不完全配对，在动物基因组中直接寻找就显得有些困难，但也有研究尝试依据其他特征用生物信息学查找，但总的来说仍需要实验检验。从仅有的例子来看，一个miRNA可调控细胞中与某一种物质代谢或信号转导途径相关的几种mRNA，这样更能有效地发挥作用。,寻找miRNA的靶基因是目前功能研究的热点之一，因为这为揭示每一个miRNA的功能提供了必不可少的线索，从而为全面了解miRNA在细胞中的功能打下基础。,（四）小结 1.miRNA作为新的研究切入点，为功能基因组学，基因治疗，转录调控机制提供了一条有效途径。2.近年来对miRNA的

23、研究已经取得了突破性进展,并且有大量的miRNA被鉴定,但是总体来说对miRNA的研究还处在理论水平上,关于miRNA的应用的例子还较少。miRNA作为体内正常表达的基因,与人类疾病（特别是肿瘤）和植物培育的关系还有待进一步研究。,3.尽管目前miRNA应用于基因治疗的尝试才刚刚开始,但已经在药物设计及疾病治疗等实际应用中显现了巨大的应用潜力,相信随着对这种特殊分子研究的不断深入,以miRNA为靶点或者以miRNA为治疗手段的设想,以后可能会成为焦点，并且将为肿瘤和其它疾病的治疗带来新的希望。这些研究成果必将促进整个生物界研究领域的进步与发展。,上皮间质转化（Epithelial-mesenc

24、hymal transition）EMT,上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是上皮细胞失去上皮特性获得间质细胞表型的一种生物现象，发生EMT 后细胞E-钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表达降低，波形蛋白、纤维连接素、N-钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。,已证实EMT参与肿瘤侵袭转移，在肿瘤转移过程中，癌细胞通过EMT 而获得间质细胞表型和侵袭性，实现对周围组织的浸润；在种植部位，癌细胞通过间质细胞-上皮细胞转化（Mesenchymal-epithelial transition，MET）最终形成与原发灶形态结构相似的转移灶。,2010年国

25、家自然科学基金委员会将“上皮间质转化在恶性肿瘤转移中的作用及机制”列为重大研究项目。,EMT 发生机制,肿瘤微环境与EMT,基质金属蛋白酶作为一组锌依赖性的高度保守的蛋白水解酶，可直接诱导癌上皮细胞发生EMT，发生EMT 后肿瘤细胞产生更多基质金属蛋白酶，促进癌细胞的侵袭与转移。,基质金属蛋白酶可能通过上调Wnt引起癌细胞发生EMT，增强癌细胞的移动、侵袭能力。基质金属蛋白酶还通过释放转化样生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等可溶性细胞因子，激活多种下游信号转导，促进肿瘤细胞的侵袭与转移。,肿瘤细胞产生的集落刺激因子可刺激巨噬细胞合成表皮生长因子，诱导并促进肿瘤迁徙与侵袭相关基因的表达上

26、调，同时使胞内E-钙黏蛋白的表达降低，促进EMT 的快速转化。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）除参与血管生成外，也可以通过自分泌促进肿瘤细胞EMT 的发生。,激酶类与EMT,蛋白激酶在信号转导中位于生长因子下游，Src激酶、Rho激酶是研究较早的激酶；Src激酶可能通过三种途径参与EMT的过程。,Src使细胞骨架以及黏附结构的成分发生磷酸化,从而改变细胞结构引起细胞移动；可以诱导c-myc,影响细胞进入S期；Src还可以与其他信号途径相互作用，如活化Ras-MAPK等信号通路途径。,Rho家族激酶可诱导张力纤维形成、调控细胞骨架

27、蛋白、细胞黏附和细胞能动性，可以为膜内CD44、CD43、ICAM与骨架成分之间的连接提供支持，通过参与骨架胞膜的锚定及细胞黏附作用的修饰调控细胞表型。,G-蛋白偶联受体酪氨酸激酶激活后可通过MAPK信号通路将胞外信号转人核内，影响相关基因表达，介导EMT发生。细胞外信号调节激酶（ERK）作为丝/苏氨酸蛋白激酶的一种，也参与调控EMT的过程。,转录因子与EMT,转录因子在信号转导中位于蛋白激酶下游，目前发现Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad、NF-B 等转录因子与EMT 密切相关。,Snail 与Slug 同属于一个转录因子家族，两者不仅可以与Smad 的相互作用蛋白（sip

28、1）竞争性结合E-钙黏蛋白启动子区的E-box 连接基序，抑制E-钙黏蛋白的表达及波形蛋白的表达水平的上升，也可以经由形成-连环-T 细胞因子-4（TCF-4）转录复合体，来促进EMT 的发生。,Twist 蛋白作为一个碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，也通过与E-box 序列结合来抑制E-钙黏蛋白的表达，诱导EMT 的发生,Zeb1 与SIP1 结构相似，同属ZEB 家族，ZEB1 与SIP1 均能结合TGF-信号通路中的R-smads，并在TGF-信号刺激下，与R-smad-smad4 复合体直接结合，调节SMA、p21、p15 等多个与EMT 相关的基因转录。,NF-B 可以通过AKT

29、上调snail 的表达，也可以通过抑制E-钙黏蛋白的表达并且上调ZEB1，ZEB2 因子而增强EMT 的发生。,其它调控因子与EMT,mir-200 与mir-205 可以调节ZEB1 与ZEB2 因子，抑制E-钙黏蛋白的表达，而引起EMT 发生。花生四烯酸可以提高波形蛋白及N-钙黏蛋白表达，降低E-钙黏蛋白表达，并且激活FAK，Src 与NF-kB 等途径而诱导乳腺癌细胞MCF10A 发生EMT。,HIF-过表达可以通过调控E-钙黏蛋白以及波形蛋白表达而诱导前列腺癌发生EMT。BMP-2 可以通过PI3K/AKT 途径诱导胃癌细胞发生EMT，引起肿瘤的侵袭转移。Cox-2 可以抑制smad

30、信号,同时通过一个PGE2 依赖机制而经由TGF-途径增强EMT的发生。,EMT generates cancer stem-like cells from epithelial cancer cells,Ouyang G.Cell.Mol.Life Sci.2010,问题?,EMT 不仅在胚胎形成发育中起重要作用，而且在肿瘤侵袭转移中同样也发挥重要作用。因此，对EMT分子调控机制的研究为预防肿瘤转移提供一个有利的平台。EMT 涉及到众多的调控机制，许多有关EMT的调控机制已被报道，但详细调控机制仍不清楚，如生长因子在诱导EMT 过程中怎样联系；作为转录因子的Twist 诱导EMT的详细调控机

31、制是什么。,miRNAs 作为一类新型的调控转录后基因表达水平的小分子RNAs，在肿瘤中既可高表达，又可低表达，并与肿瘤EMT 的发生有着密切的联系，而它们的调控机制还需进一步研究。EMT调控因子可使肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤侵袭转移。目前越来越多的学者开始致力于通过各种方法抑制EMT而降低肿瘤的侵袭与转移，已有试验针对TGF-1 抑制EMT，从而逆转肿瘤侵袭，如使用TGF-阻滞剂降低肿瘤的侵袭性。,骨形成蛋白(bone morpho-genetic protein,BMP)也可逆转TGF-1 引起E-钙黏蛋白表达下调。EMT的发生所涉及到众多调控机制中大多数都是建立在体外实验基础上研究的，

32、但由于体内外环境差别较大，要想更好地了解EMT的调控机制及其在肿瘤侵袭转移中的作用，必须探讨EMT在体内的研究，才能更好地为临床肿瘤发生与转移的预防和治疗提供新思路。,显微切割技术 Microdissection Technique,(一)显微切割的概念 在显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相同的细胞从组织三维构造（异质性组织）中分离出来，获得某一特定（纯）的细胞群。,为什么要显微切割?(1)样本为异质性组织，而研究需要同质性组织或细胞，如HL的RS细胞和R-S/H细胞的起源；(2)普通方法难以进行DNA、RNA、蛋白的定量分析；(3)精确到一个特定的细

33、胞、细胞器、染色体进行分子病理学研究，高度敏感性和高度特异性。,(二)显微切割技术的特点1.“细微”由于是在显微状态并采用特殊的分离收集手段，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和包涵体及染色体特异区带这样细微的对象；2.“原位”利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。,3.“同质”显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性，例如它可以收集CD4或CD8阳性的同质细胞；4.“结合”显微切割技术可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。正是由于显微切割技术具有上

34、述特点或者称为优势，其在分子病理学研究中的应用十分广泛。,(三)显微切割技术的发展 1.解剖刀刮除组织 2.显微操作仪引导下,用解剖针或吸管手动切割提取 3.选择性紫外辐射分离技术 4.非接触性激光显微切割技术 5.激光捕获显微切割术（laser capture microdissection，LCM）,(四)显微切割的方法 1材料 2切割及采集方法 手工操作及仪器操作 显微操作仪液压控制手工操作 激光捕获显微切割,Olympus公司laser capture microdissection systemleica公司第三代激光显微切割系统。,LCM 原理倒置,LCM 原理正置,显微切割前后对

35、比,Leica LMD 6000,(五)显微切割的结合技术 显微切割时究竟选择什么样的细胞完全取决于研究的目的，但如何识别欲切割的细胞及如何对已切割的细胞进行分析，则需要和其它方法相结合。根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记，显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。,(六)显微切割技术的应用 特定的组织、细胞的DNA、RNA、蛋白质的精确、无污染的切割和

36、分离。1DNA水平 克隆性分析、定量PCR，Southern印迹杂交、测序比较基因组杂交 2RNA水平 总RNA、RT-PCR、Northern杂交，cDNA文库3蛋白质水平 ZD-SDS-PAGF如HL的R-S/H细胞的研究；胃癌cDNA文库；组合性淋巴瘤；,原位杂交技术 In Situ Hybridization，ISH,（一）原位杂交技术的概念,原位杂交技术in situ hybridization，ISH 是核酸分子杂交的一部分,是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。ISH是用标记了的已知序列的核甘酸片段作为探针probe，通过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞

37、爬片上检测和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。,1.ISH的生物化学基础是DNA 变性、复性、和碱基互补配对。2.根据探针和靶序列的不同：DNA-DNA杂交，DNA-RNA和RNA-RNA杂交。,（二）原位杂交技术的基本原理,（三）原位杂交的主要程序 1.实验材料：石蜡包埋组织、冰冻切片、细胞涂片 2.主要程序：杂交前准备、预处理、杂交、杂交后处理、清洗、杂交体检测 3.注意事项：DNA-RNA，RNA-RNA杂交需要进行灭活RNA酶处理，杂交温度应低于杂交体的解链温度，对照实验,（四）FISH（Fluorescence in situ hybridization）,所谓FISH是指基于D

38、NA双链互补的特性，将荧光标记的DNA片段(探针)特异性杂交于靶核酸序列(染色体或基因)，然后通过荧光显微镜观察结合到靶目标上的探针，检测某一特定靶核酸序列变化，从而判定其结构和数目异常的一种技术。,FISH有中期FISH(metaphase FISH)和间期FISH(interphase FISH)两种。中期FISH是指在细胞分裂期的中期(metaphase)而进行的FISH检测，该方法因需要新鲜组织和细胞，并需要制备中期染色体，故在应用上受到很大限制。间期FISH是指在细胞分裂间期(interphase)而进行的FISH检测，该技术不仅适用于新鲜组织，也可应用于经中性甲醛固定、石蜡包埋的组

39、织，并可以将组织形态学和分子遗传学改变相互联系，因而是日常分子病理学诊断工作中的一个非常有用的手段，现已被广泛应用于淋巴瘤等肿瘤的分子诊断。,FISH的常用探针,FISH探针通常是一小段荧光素标记的DNA片段，被用作寻找另一互补DNA(靶标)的指示。常用于检测淋巴瘤分子遗传学异常的探针有三种。,1双色分离重排探针(dual color break apart rearrangement probe),双色分离重排探针以绿色荧光标记某一基因的一端，以橙色荧光标记另一端。在相应双色滤光片下观察，正常间期细胞核中存在橙色荧光和绿色荧光融合而成的两个融合信号。,1双色分离重排探针(dual color

40、 break apart rearrangement probe),当相应基因出现断裂时(如与另一染色体上的基因发生易位)，间期细胞核中出现一个融合信号、一个橙色信号和一个绿色信号。当细胞核内出现2个以上融合信号时，表明所检测靶基因的拷贝数增多(获得或扩增)。当细胞核内融合信号少于2个时，表明所检测靶基因的拷贝数减少(缺失)。,1双色分离重排探针(dual color break apart rearrangement probe),双色分离重排探针既可检测基因数目的改变，也可检测基因结构的改变。但以此探针检测涉及某一基因的染色体易位时，无法确定与该基因发生相互易位的伙伴基因。,2双色双融合易

41、位探针(dual color，dual fusion translocation probe),双色双融合易位探针以绿色荧光标记一个基因，以橙色荧光标记另一个基因。正常情况下，细胞核中显示两个橙色信号和两个绿色信号。,2双色双融合易位探针(dual color，dual fusion translocation probe),当存在染色体易位时，细胞核中则出现基因融合的信号，典型表现为细胞核中有两个融合信号、一个橙色和一个绿色信号。若细胞核内出现多于2个的橙色或绿色信号，表明相应基因的拷贝数增多(获得或扩增)。当细胞核内橙色或绿色信号少于2个时，表明所相应基因的拷贝数减少(缺失)。,2双色双融

42、合易位探针(dual color，dual fusion translocation probe),双色双融合易位探针同样既可检测基因数量的改变，也可检测基因结构的改变。与双色分离重排探针不同的是，以此探针检测染色体易位时，可以确定与相应基因发生相互易位的伙伴基因。,3染色体计数探针(chromosome enumeration probe，CEP),染色体计数探针以橙色荧光或绿色荧光标记染色体的着丝粒，故又称着丝粒特异性探针。正常的情况下，在细胞核中显示两个橙色或两个绿色信号，当存在相应染色体数量异常时，细胞核中则显示多于或少于两个橙色或绿色的信号。染色体计数探针用于检测染色体单体、三体等数

43、目异常的变化。,淋巴瘤荧光原位杂交试剂盒,间期FISH的操作过程,4 u m厚的石蜡切片常规脱蜡、水化后，胃蛋白酶消化，梯度乙醇脱水、空气干燥。之后，加FISH探针并于水浴箱中孵育使DNA及探针变性，于避光状态下杂交。杂交结束后，以梯度SSC液清洗以去除未结合探针。用含有DAPI的抗荧光衰退的封片剂封片，荧光显微镜下观察结果，并采集图像。FISH实验中，要设定相应基因异常的阴性和阳性对照。此外，各实验室需建立本室的cut-off值。,样本预处理探针、样本变性探针样本杂交杂交后洗涤结果观察,五步完成实验操作,FISH的结果解释,FISH结果的阳性和阴性确定，依赖于所使用的探针。在分析解释临床样本

44、之前，首先要明确所用探针，并要先观察对照。如果对照的结果不正确，那么检测无效，临床样本结果不能解释。,FISH技术的特点,操作简单 检测快速 结果易观察灵敏性和特异性高可检测样本种类多 空间定位精确,间期FISH的局限性,1间期FISH无法确定基因在染色体中重排的断裂点。2信号会受组织切片质量(如组织固定不好或者切片过厚)的影响。最后，需要强调的是，利用间期FISH进行分子遗传学异常的检测，需要以分子生物学、遗传学知识和病理形态学作为基础。结果的解释一定要结合l临床、形态学、免疫组织化学资料进行综合分析，然后对肿瘤做出最后诊断和分类。,（五）原位杂交技术的应用 1.细胞特异性mRNA转录的定位

45、，基因图谱、基因表达和基因组化的研究 2.病毒DNA/RNA的检测和定位 3.癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测 4.基因在染色体上的定位 5.检测染色体的变化 6.分裂间期细胞遗传学的研究,尖锐湿疣？,尖锐湿疣HPV-DNA检测,一对X染色体,间期细胞x染色体（绿色），y染色体（红色）,一对12号染色体,RNAi(RNA interference)RNA干扰技术,（一）RNAi的概念 RNAi:将与内源mRNA编码区同源的小片段（19-23bp）外源双链RNA（double stranded RNA）导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mRNA的降解，从而

46、导致特定基因表达沉默的一种技术。引入的外源双链RNA又称siRNA(small interfering RNA),（二）RNAi的意义 RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。,（三）RNAi 的方法 1.siRNA的获得(1)化学合成(2)体外转录(3)长片断dsRNAs经RNase III 类降解(4)siRNA表达载体或者病毒载体,我们一般选择使用siRNA表达载体法构建载体。载体在真核细胞中可转录出shRNA，shRNA的

47、环状结构被切除，产生siRNA，siRNA的反义链在细胞内与特定蛋白质结合形成RISCs（RNA-induced silencing complexes），并且通过反义链与特异mRNA序列互补结合，剪切mRNA导致mRNA降解，从而在细胞内产生特定基因的沉默效果。此方法是多种siRNA制备方法中唯一可以进行长期基因沉默研究的方法。,2.siRNA 表达载体具有以下优点（1）siRNA表达载体是一种双链DNA结构，与体外合成siRNA相比，更稳定、不易降解。其载体的保存和使用过程中，均是对DNA进行操作，操作过程简单方便，实验稳定性强。纯化后的表达载体可永久保存于-20。（2）载体中加有新霉素抗

48、性标记，载体转染细胞后加入含G418的培养基进行培养，未转染载体的细胞因不具有新霉素抗性而死亡。由此可以快速筛选出载体成功转染的细胞，消除未转染细胞对研究基因表达沉默现象的影响。,（3）载体上携带有GFP绿色荧光标记，在转染入细胞后，载体同时表达GFP蛋白。此蛋白是一种很好的活体分子标记物。（4）当需要大量的siRNA表达载体时，可以将载体质粒转化到大肠杆菌中（如DH5），在含有氨苄青霉素的培养基中培养，无限量扩增表达载体。,3.siRNA载体构建程序 根据目的mRNA序列，设计RNA干扰靶序列，靶序列一般为1921nt 对每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(

49、9nt)相连 合成每条编码shRNA(短发夹RNA)的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板 酶切后，回收线性载体 把退火的DNA模板双链连接到线性载体中转染DH5大肠杆菌 在LB Amp培养基上涂板，37培养过夜 挑取转染的菌落PCR鉴定。,（四）siRNA的干扰机制图,生物芯片技术（Biochip technique）,生物芯片技术是用于生物医学研究的高通量技术，包括：基因芯片、蛋白芯片和组织芯片。,（一）基因芯片（gene chip）,基因芯片DNA芯片，是指固着在固相载体上的高密度的DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在固相载体（硅

50、片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜）上。基因芯片分析系统：芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处理系统。,基因芯片的分类及工作原理,分类：表达谱基因芯片、诊断芯片和检测芯片表达谱基因芯片检测到基本原理：用不同荧光染料通过逆转录反应将不同组织的mRNA分别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的DNA片段杂交，洗涤后用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，在通过计算机分析出这些基因在不同组织中的表达差异。,基因芯片的应用,基因表达谱分析、基因分型、基因突变检测、新基因的寻找、基因作图抗生素和抗肿瘤药物的筛选、疾病诊断。,（二）蛋白芯片（protein chip）,亦称蛋