肿瘤分子生物学PPT.ppt

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1、,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室（TEL:028-85164041),分子肿瘤学(Molecular Oncology),朱 文,肿瘤(Tumor)肿瘤是机体中正常细胞，在不同始动与促进因素长期作用下所产生的增生与异常分化所形成的新生物,良性,恶性,肿瘤(tumor),Carcinoma癌,Sarcoma 肉瘤,Leukemia 白血病,癌症(cancer),肿瘤的特点,1不受控制的异常生长(新生物一旦形成，不因病因消除而停止增生)2侵袭转移3威胁生命难以治愈4 通过许多年变异和自然选择，癌细胞学会了多变，能规避人体精复杂的生长控制系统5 打破消灭异常细胞的细胞自杀机制6 进化出对免疫

2、系统监视的抵抗力。,目前肿瘤治疗的现状,诊断：中、晚期 治疗：放射治疗、化学治疗、手术治疗（盲目、被动）近40余年,美国政府耗资1000亿用于肿瘤的研究和治疗原因:基因组改变信号转导异常细胞转化细胞恶性增殖等的机制不确定,肿瘤发病机理的研究历史,1775年:英国内科医生Percival Pott 发现肿瘤的发生与环境因素有关1838年:Muller 首次提出肿瘤发生是由于正常细胞结构破坏的 累积所致,导致实验肿瘤学的诞生 1952年:Boyland 第一次证明了致癌物主要作用于DNA而非酶和蛋白质1964年:Brooks用实验证明致癌物可以使DNA发生突 变,同时也明确了某些致癌物的致癌性与D

3、NA亲合性之间有直接关系1969年:Harris 提出恶性肿瘤中可能有一种抑制肿瘤恶性生长的基因1970年:认为肿瘤的发生发展是环境和遗传因素相互作用的结果，确立了环境致癌和遗传因素与细胞癌变关系,(一）外界因素化学因素:(1)烷化剂：如有机农药、硫芥等(2)多环芳香烃化合物：34-苯并芘(3)氨基偶氮类：染料类(4)亚硝胺类(5)真菌毒素和植物毒素：黄曲霉菌、苏铁素等(6)其他：重金属2.物理因素(1)电离辐射(2)紫外线(3)其他：石棉纤维滑石粉3.生物因素 主要是病毒感染：如EB病毒乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒,(二）内在因素,1.遗传因素（DNA损伤修复功能）2.内分泌因素3.免疫因素

4、,基因组遗传型、表型和环境的相互作用,环境因素,物理因素化学因素生物因素,体内微环境,做“人”很难,人类基因组,分子肿瘤学,应用分子生物学理论阐明肿瘤发生发展及其本质,运用分子生物学技术研究肿瘤相关基因及其表达产物在肿瘤发生、发展中的作用,为肿瘤的预防诊断和治疗提供新措施的一门学科从根本上揭示肿瘤发生发展的机制，是目前肿瘤学研究的基石,目前国际上对于肿瘤发生分子机制的基础研究主要集中在以下三大领域:,肿瘤相关基因的克隆和功能分析细胞信号传导通路细胞周期调控,肿瘤产生的分子基础,1953年沃森和克里克提出了DNA 的双螺旋结构，他们在Nature上写道:这种结构具有在生物学上相当重要的新特征DN

5、A结构和中心法则的发现，使肿瘤分子生物学的研究取得了突破性的进展,为研究基因缺陷与肿瘤的关系开创了一个新时代,A T A T G G G T A C G G T,T A T A C C C A T G C C A,A T G C G T A G T,T A C G A T C A,遗传物质的半保留复制理论,遗传物质DNA通过半保留复制法,将亲本的遗传物质 分别完全一样传送入两个子代细胞中,保证了遗传的稳定性,DNA 分子的结构改变,DNA 分子的自发断裂和碱基的丢失DNA的自我复制造成的错误各种各样的致癌剂对DNA分子的损伤病毒的DNA分子可整合到细胞的DNA中去,引起DNA结构的改变,DNA

6、分子结构改变最基本的方式,碱基对的改变的主要形式有:替代、缺失、插入、颠换,致癌剂对DNA分子的损伤,碱基二聚体形成碱基加合物形成碱基缺失碱基取代和碱基错配,致癌剂对DNA的损伤,DNA加合物的形成是DNA分子结构改变的重要方式之一,致癌物转化为DNA加合物及其后果,病毒对DNA分子的损伤,RNA病毒基因整合到细胞DNA的基因组上,引起基因的突变,DNA损伤使DNA分子的结构性质和功能发生改变维持DNA损伤的存在和积累,存在于DNA分子上的基因就会改变 基因的改变 细胞癌变,肿瘤是一种环境因素与遗传因素相互作用导致的疾病,大多数的环境致病因素的致癌作用都是通过影响遗传基因起作用的肿瘤的发生是由

7、于细胞中基因改变积累的结果，包括（1）癌基因的激活、过度表达（2）抑癌基因的突变、丢失(3）微卫星不稳定，出现核苷酸异常的串联重复分 布于基因组（4）错配修复基因突变，导致细胞遗传不稳定或致 肿瘤易感性,癌基因(Oncogene),Oncogenes are essential for human life activity,whose normal function is to control cellular growth and differentiation/apoptosis or,in different terms,cell birth and cell death.Corres

8、pondingly,their structural and/or functional alterations lead uncontrolled cellular growth and abnormal differentiation/apoptosis,原癌基因（proto-oncogene),细胞中固有的基因，在正常情况下参与细胞的增殖与分化的调控,是调控细胞增殖与分化的一类基因,当基因结构和功能发生变异并使细胞发生恶性转化时，这样的基因才叫癌基因(oncogene).由于细胞癌基因在正常细胞中以非激活形式存在，故又称为原癌基因.,原癌基因的特点,广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞普

9、遍存在在进化进程中，基因序列呈高度保守性它的作用是通过其表达产物蛋白质来体现的；它们的存在对正常细胞不仅无害，而且对维持正常生理功能、调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需在某些因素（如放射线、某些化学物质等）作用下，一旦被激活，发生数量上或结构上的变化时，就会形成癌性的细胞转化基因,癌基因研究的发展历史,1969年,Rous医生等在研究鸡肉瘤时发现罗氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus,RSV)1975年,Bishop 从RSV中分离到第一个病毒癌基因（v-Src)，Src基因编码60-kDa 的酪氨酸蛋白激酶1976年,Sehelin以实验证明正常

10、鸡成纤维细胞基因组中存在有病毒癌基因v-Src的同源序列c-Src,Huebner RJ,Todaro GJ.Oncogenes of RNA tumor viruses as determinants of cancer.Proc Natl Acad Sci U S A.1969,64(3):1087-94.,1982年Weinberg等通过基因转染技术从不同的人膀胱癌细胞系中分离到具有致癌活性的活化癌基因H-ras，并发现其相对应的细胞原癌基因之间只有一个碱基对的区别目前已发现100多种癌基因包括Ras、c-myc、Bcl-2等,原癌基因的种类,生长因子受体信号转导分子转录因子细胞程序性死

11、亡及凋亡 蛋白细胞周期蛋白,细胞核细胞浆细胞膜分泌到胞外,生物学功能,存在位置,人类肿瘤中原癌基因的激活途径,原癌基因,1.点突变与癌基因,原癌基因,癌基因激活的主要方式 在基因的编码顺序上一个碱基对被另一碱基对所置换 乳腺癌 肺癌 肝癌 结肠癌等癌细胞中均发现了H-ras原癌基因的点突变,癌基因变异方式和活化,点突变经常可以在Ras原癌基因家族(K-Ras,H-RAS,N-Ras)中检测到人类肿瘤中主要是K-ras第12位密码子GGC变为GTC,编码的氨基酸由甘氨酸变为颉氨酸，这样其产物p21-Ras蛋白的结构发生变化而导致基因的活化30%的肺癌、50%结肠癌、90%胰腺癌中有K-Ras突变

12、,点突变的检测方法,限制性内切酶长度多态性（restriction endonuclease fragement longth polymophism,REFLP)单链构向多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP)寡核苷酸探针杂交变性高压液相色谱（DHPLC）PCR直接测序,2.DNA扩增和癌基因,原癌基因,癌基因活化的另一种主要方式 细胞内一些基因通过不明原因 复制成多拷贝 原癌基因拷贝数的增加会导致 基因产物的增加,从而引起细 胞正常功能的紊乱 原癌基因myc,erbB 和Ras的扩 增在人 类肿瘤中最为常见,原癌基因,原癌基因中染色

13、体某一部分从一个位置移动到另一位置,使原癌基因的结构改变,使原癌基因激活,这种改变称为基因重排 通过对肿瘤组织和细胞系的染色体分析，发现在各种肿瘤中都有染色体结构的异常。染色体易位在血液系统的肿瘤中最为常见,3.染色体重排与癌基因,Chromosomes involved in the Ph-translocation.Banded chromosomes 9 and 22 are shown,as well as the products of the t(9;22)including the 9q+and 22q-(Ph)chromosomes,Translocations-Bcr/Abl

14、,Oncogene 21;8536-8540(2002),4.基因缺失与癌基因,肿瘤细胞中常发现有原癌基因DNA片段缺失，原癌基因内小的缺失，可使在正常情况下抑制蛋白活性的那部分蛋白缺失或诱导产生类似于正常的刺激信号，导致细胞的过度增殖,5.原癌基因的甲基化改变,DNA甲基化,DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基,在人类基因组DNA中，约34%的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在大

15、约7080的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核苷酸集中的区域称之为CpG岛限制性内切酶HapII 和MspI 均能识别CCGG,但不能识别 Cm CmGG,DNA甲基化的生物学功能,通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达DNA的甲基化对维持染色体的结构和肿瘤的发生发展都起重要的作用,是细胞癌变过程中的重要一步,肿瘤中DNA甲基化的作用,肿瘤局部相关基因的高甲基化：肿瘤抑制基 因沉默 肿瘤中整体的低甲基化：,肿瘤中整体的低甲基化,肿瘤组织相对于正常组织整体呈现低甲基化状态 目前有3种机制解释基因组整体的

16、低甲基化在肿瘤中所扮演的作用：1.低甲基化导致原癌基因的去甲基化失活，导致癌基因的大量 表达（Myc 基因）2.整体的低甲基化是细胞染色体不稳定的易感因素 3.低甲基化使肿瘤转移增加,DNA甲基化水平愈低 肿瘤的浸润 能力就越高，临床分期也愈晚,肿瘤局部相关基因的高甲基化,近几年研究发现,在癌细胞中,肿瘤抑制基因甲基化的发生率与肿瘤抑制基因突变或缺失发生的概率大致相等,均可导致肿瘤抑制基因功能的丧失，如结肠癌、胃癌中hMLH1基因高甲基化导致DNA错配修复的缺失；脑肿瘤、结肠癌中MGMT基因的高甲基化导致化疗敏感性降低。一些DNA甲基化抑制剂,例如5-氮杂胞苷和5-氮杂脱氧胞苷可以使失活的肿瘤

17、抑制基因恢复其正常功能,为白血病和其他相关疾病的治疗提供了新的手段。,肿瘤中DNA甲基化的应用,肿瘤筛查和风险评估：甲基化检测能够有效预测不同肿瘤中个体的风险率肿瘤病理分型和治疗：甲基化指标的鉴定有助于肿瘤的临床病理分型，体外应用DNA甲基化抑制剂活化沉默的高甲基化基因肿瘤治疗监测：一个或者多个基因的甲基化状态与肿瘤的复发或者生存率相关DNA甲基化研究是肿瘤分子生物学研究的一个重要领域,6.原癌基因获得活化因子,慢性转化逆转录病毒感染细胞后,分别通过整合进宿主染色体导致染色体易位，或通过插入突变激活原癌基因，使原癌基因获得活化，造成此处原癌基因被激活，异常转录或表达。原癌基因Int-1,Int

18、-2,Pim-1,Lck 等均是通过插入突变的鉴定而发现的,不同的癌基因有不同的激活方式，一种癌基因也可有几种激活方式例如c-myc的激活就有基因扩增和基因重排两种方式，很少见c-myc的突变；而ras的激活方式则主要是突变,大部分肿瘤的基因改变都是后天获得的，即体细胞发生基因改变 癌基因一般为显性基因，即两个等位基因中只要有一个等位基因发生激活，其功能即表现出来 大多数抑癌基因作用方式为负隐性,人类肿瘤中常见的癌基因,Ras基因,1980年从膀胱癌细胞株T24中克隆了第一个人癌基因 H-ras,后来又发现了K-ras 和N-ras 都编码鸟苷酸结合蛋白,分子量21000 肿瘤中以K-Ras

19、为主,H-Ras,N-Ras较少见 Ras蛋白在细胞增殖分化信号从激活的跨膜受体 传递到下游蛋白激酶过程中起重要作用,Ras基因的突变与肿瘤,Ras基因在肿瘤中的改变以点突变为主K-ras 基因的点突变主要集中在第12位氨基酸残基,少数也有第13及61位点突变已在膀胱癌乳腺癌结肠癌肾癌肝癌肺癌胰腺癌胃癌及造血系统肿瘤中均检测到了Ras基因的异常不同类型的肿瘤 Ras 基因的突变率明显不同 胰腺癌（90%）结肠癌(53%）肺癌(30%）,Ras基因的作用机理,Ras蛋白位于细胞膜内侧Ras蛋白对GTP 和GDP有高度亲和力Ras 蛋白有活化和非活化两种形式，通常非活化状态的Ras蛋白分子能与GD

20、P结合，在受到信号传递通道上游某因子的刺激时，GDP变成GTP，随后蛋白发生构象改变，成为活化状态，活化的Ras 蛋白与效应分子相互作用，实现生长信号的传递,Bcl-2(B cell leukaemia-2)基因,从B细胞淋巴瘤中鉴定出来的癌基因,由染色体易位而激活 编码25KDa的线粒体膜蛋白,是一种重要的抗凋亡基因,能抑制多种因素引起的细胞凋亡,Bcl-2家族与肿瘤发生及转移,Bcl-2在前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤中有高频率的表达Bcl-2家族成员的异常表达还参与肿瘤的转移过程.Bcl-2高表达可导致转移潜能的增加,表现为转移出现的时间缩短和发生转移的器官数增加,Bcl-2基因与肿

21、瘤治疗,Bcl-2家族成员在细胞凋亡调控中的重要作用,成为肿瘤治疗的新靶点多数人类肿瘤中均有Bcl-2 的高表达,以此为靶点的药物将具有较广的抗癌谱,Myc基因,最初是从鸡白血病病毒中发现(主要有C-Myc,N-Myc L-Myc,但以C-Myc为主)在人类中它的活化方式首次在Burkitt淋巴瘤中发现,可通过染色体易位而活化在某些肿瘤中,Myc基因还受DNA扩增影响,在肺癌中Myc家族癌基因的激活以扩增为主,Myc基因的功能,Myc基因参与细胞的增殖、分化与凋亡与多种肿瘤的发生发展有关,在胃癌、肺癌、乳腺癌及白血病等肿瘤中均有显著表达 体外实验证实c-myc基因可与其他癌基因协同转化多种细胞

22、,Mdm-2基因,最初在自发转化的鼠BALB/c3T3细胞系中因扩增而被发现Mdm-2 是一种进化保守基因在多种肿瘤中都发现有Mdm-2扩增是p53转录调节的靶基因之一,也是p53重要的调节因子,Mdm2基因的致癌机制,依赖于p53 的致癌机制:Mdm2基因的扩增和转录的增加均可导致Mdm2蛋白的过表达,阻止了p53基因的表达使其抑癌作用被抑制不依赖p53 的致癌机制:1.Mdm2基因转录产物的选择性剪接:五种选择性剪切蛋白中,只有一种(Mdm2a-e)与p53结合,其他都有细胞转化的能力 2.Mdm2基因的突变:白血病,肝癌,骨肉瘤,抑癌基因,(tumor suppressor gene),

23、是一类正常的基因,这类基因作为细胞的刹车而起作用。它们编码的蛋白能够抑制细胞的生长，阻止细胞恶性转变。如果其功能失活或出现基因缺失、突变等异常，将导致细胞无限制地生长和分裂,形成肿瘤。,如果其功能失活或出现基因缺失、突变等异常，将导致细胞无限制地生长和分裂,形成肿瘤。,抑癌基因在理论上需符合的三个基本条件,在恶性肿瘤的相应正常组织中该基因必须正常表达在恶性肿瘤中这种基因应有功能或结构改变或表达缺陷将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内,可部分或全部改变其恶性表型,抑癌基因的功能,调节细胞生长增殖诱导细胞分化诱导细胞凋亡调节血管生成维持其他基因的功能,抑癌基因与癌基因的差别,在细胞水平抑癌基

24、因表现为隐性，原癌基因是显性的在功能上抑癌基因对细胞生长起负调节作用，癌基因则相反抑癌基因的隐性突变不影响遗传物质的正常传递,带 有单一等位基因突变的抑癌基因能够被传给下一代,使这些个体具有相应疾病的易感性.,抑癌基因的研究历史,1960年在研究儿童视网膜母细胞瘤的基因突变时,发现了抑癌基因的功能1986年Weiberg等克隆出了与视网膜母细胞瘤有关的抑癌基因Rb目前已克隆的抑癌基因和未被克隆的候选抑癌基因已超过40余种,Rb 基因,视网膜细胞癌基因(retinoblastmoma gene,Rb)是第一个被克隆的抑癌基因，发现于儿童的视网膜母细胞瘤.1986年美国的三个实验室分别独立克隆了该

25、基因在肺癌骨肉瘤和乳腺癌中也发现有Rb基因的缺失和失活（小细胞肺癌中异常为50%骨肉瘤47%乳腺癌32%),Rb 基因缺失,Rb基因比较大，全长约200kb,编码核内磷酸化蛋白（pRb蛋白），定位于核内有磷酸化和非磷酸化两种形式，非磷酸化形式称活性型，能抑制细胞增殖 pRb的肿瘤抑制作用是通过其对细胞增殖,分化和细胞凋亡的调节来进行的,Rb 基因和细胞周期调控,Rb的磷酸化状态为Rb 基因调节细胞生长分化的主要形式2.调节Rb功能最为重要的磷酸化事件在G1和S期交界处3.磷酸化可以使Rb与细胞内蛋白形成复合物的能力丧失4.在G1期，Rb 为去磷酸化的状态，当细胞开始进入S期，磷酸化状态急剧,R

26、b基因的磷酸化,Rb 基因调控细胞周期的机制,Rb基因异常与肿瘤,基因的异常主要表现为等位基因缺失和基因突变在视网膜细胞瘤小细胞肺癌非小细胞肺癌膀胱癌乳腺癌软组织肉瘤肝癌等肿瘤中发现有高频率的等位基因丢失和基因突变在肿瘤的发生中，Rb 基因与p53 C-myc C-fosTGF等还存在相互调节的关系Rb 与其他相关基因间的调节机制尚需进一步阐明,是tumor suppressor gene 一明珠，Pubmed有超过3万篇论文，1979年，发现SV40转化的细胞中与SV40-large T抗原结合，而被误认为癌基因，直到1989年才被证实为抑癌基因,DeLeo AB,Jay G,Appella

27、 E,Dubois GC,Law LW,Old LJ.Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transformed cells of the mouse.Proc Natl Acad Sci U S A.1979 May;76(5):2420-4.,Baker SJ,Markowitz S,Fearon ER,Willson JK,Vogelstein B.Suppression of human colorectal carcinoma cell growt

28、h by wild-type p53.Science.1990 Aug 24;249(4971):912-5.,p53和肿瘤,p53基因异常与肿瘤,p53 基因的缺失或突变已被证实是人类肿瘤中p53功能丧失的主要原因，突变形式可表现为点突变缺失突变 插入突变 移码突变目前已知的突变位点约有3500种，多集中于第5-8外显子p53基因甲基化状态的变化也是较为常见的基因异常,在胃癌结直肠癌膀胱癌乳腺癌头颈部鳞状细胞癌肺癌前列腺癌肝癌软组织肉瘤淋巴造血系统肿瘤等都发现有p53 的点突变在乳腺癌肺癌骨肉瘤结肠癌中发现有 p53的基因缺失异常,p53基因的结构,p53基因全长20kb，定位于人类染色体1

29、7p13.1，由11个外显子组成 编码393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能,p53的细胞生物学功能,细胞周期中的负调节因子，与细胞周期的调控DNA修复细胞分化细胞凋亡等重要的生物学功能相关p53 在细胞内的核心作用是介导DNA损伤后的细胞应激反应,维持细胞的遗传稳定性 对细胞周期的调节主要在G1/S控制点起作用,以决定细胞是否启动DNA合成或决定细胞是否进行细胞凋亡,p53蛋白具有转录调节作用,其中央核心区域可与细胞内的转录因子结合，起到活化和调节的作用 与CDK活性相关的p21基因 与DNA损伤导致细胞生长受阻相关的GADD45基因目前已发

30、现p53激活转录的基因有107种,抑制转录活性的基因有54种与p53关系最密切的基因是Mdm2和p21,p53的细胞生物学功能,p16 基因,属于INK4(inhibitors of CDK)基因家族(p16,p15,p18,p19)，为主要成员1994年由 Kamb等人在观察黑色素瘤细胞中发现是一种重要的多肿瘤抑制基因,p16基因的结构和生物学特性,基因定位于人类染色体9p21位，编码一种已知的细胞周期素依赖性激酶（CDK4)的抑制蛋白p16基因产物是细胞周期的直接抑制因子，能通过与cyclinD1 竞争性结合CDK4（细胞周期依赖蛋白激酶）而特异性抑制其活性，从而调节R b 的活性，阻止细

31、胞于G1期，发挥抑癌基因的作用p16蛋白在保持Rb蛋白的非磷酸化状态，抑制细胞周期的进行中扮演了重要角色,p16基因异常与肿瘤,p16基因的缺失和突变与多种肿瘤的发生密切相关(食管癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、神经胶质瘤等)突变方式及频率在各种肿瘤中极不均一,在非小细胞肺癌细胞系中的突变高达70%，而在小细胞肺癌的细胞系中却很少突变p16基因启动子5-CpG岛的异常甲基化也是基因异常的主要机制(早期肺癌),p21基因,属于CIP-KIP基因家族（p21,p27,p57）存在于染色体6p21.2区带编码164个氨基酸残基的蛋白质可抑制多种Cyclin-CDK复

32、合物的活性,参与由p53 介导的细胞DNA损伤反应，当细胞损伤时p53作为转录因子启动p21 的表达,抑制cyclin E-cdk2复合物的活性，使Rb低磷酸化，细胞不能进入S期而停滞于G1期p21与 肿瘤的关系主要是与其他相关基因间的协同作用,大多数肿瘤组织中未发现p21的突变,PTEN 基因,1997年分离鉴定，定位于人染色体10q23为p53，P16，P27基因后与肿瘤关系密切的一个新的抑癌基因编码的蛋白具有特异性蛋白磷酸酶和脂磷酸酶活性在诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡，参与胚胎的正常发育，抑制端粒酶活性，抑制肿瘤的迁移，铺展和局部粘附中具有重要的作用。,已在多种恶性肿瘤的早期和进展期发现有

33、PTEN基因的体细胞突变(子宫内膜癌脑胶质瘤肾癌卵巢癌膀胱癌乳腺癌头颈部鳞状细胞癌肺癌甲状腺癌前列腺癌淋巴瘤)是至今在子宫内膜肿瘤中鉴定的最常见的突变基因(33-55%),肿瘤转移抑制基因,(tumor metastasis suppressor gene),肿瘤转移,肿瘤细胞在病人的体内从原发部位向远地播散,到达继发组织或器官后得以继续增殖生长,形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的全过程恶性肿瘤的基本特征和重要标志对癌转移的分子机制的研究能够为癌症预后与治疗提供很好分子标记与治疗方法,肿瘤转移,肿瘤转移与转移促进基因(metastasis-promoting genes)激活或转移抑制基因(m

34、etastasis-suppressor genes)失活有关，是多种转移相关基因及转移抑制相关基因综合作用的结果肿瘤转移抑制基因的失活、突变或/和表达异常导致对肿瘤表型的调控异常，最终引起肿瘤转移,肿瘤转移抑制基因,目前比较明确的转移抑制基因共有14个:nm23-H1,BRMS1,CRSP3,DRG1,KAI1,KISS1,MKK4,RhoGDI2,RKIP,SSeCKs,VDUP1,E-cadherin，WDNM1和TIMPs,在体内可以特异性地抑制转移的形成,而不影响原发肿瘤生长的一类基因,nm23基因,1988年由 Steeg 等从7个转移潜能不同的 K-1735鼠的黑色素瘤细胞中分离

35、鉴定的第一个转移抑制基因(non metasitasis 23 cDNA)产物为152氨基酸组成的17KD胞浆蛋白质人类nm23基因有四个亚型即nm23-H1，nm23-H2,DR-nm23,nm23-H4,其中nm23-H1 与肿瘤细胞转移关系更为密切nm23-H1基因产物 具有磷酸核苷激酶（NDPK）的活性，参与核内三磷酸核苷（NTP）的形成,nm23的作用机制,参与微管的聚合，影响有丝分裂：nm23蛋白与NDPK高度同源，而NDPK是存在于胞浆和质膜上的激酶，能促使NDP（二磷酸核苷）磷酸化成NTP（三磷酸核苷）NDPK的改变可以引起NTP 产生不足，影响细胞骨架系统中微管蛋白的聚合，抑

36、制细胞有丝分裂中纺锤体的形成，从而导致染色体的畸变，促使肿瘤发生,nm23的作用机制,影响细胞信号传导系统：nm23-H1基因转染能阻断人高转移大细胞肺癌细胞株（L9981）PKC和ERK的信号传导通路，能上调人高转移大细胞细胞株（L9981）Wnt信号通路关键激酶GSK-3的表达和活性，靶向阻断人大细胞肺癌细胞株(L9981)Wnt信号传导通路,nm23的作用机制,与其它癌基因相互调控，共同影响肿瘤细胞的增殖与转移潜能:在“肺癌转移抑制级联”中上调-catenin，E-cadherin，TIMP-1基因的mRNA和蛋白转录表达,下调MMP-2，MMP-9，CD44V6，VEGF，E-sele

37、tion基因的mRNA和蛋白转录表达.,Nm23-H1与肺癌,Nm23-H1基因的表达水平降低、基因的缺失和突变与肺癌的发生发展转移和预后存在一定的内在联系用 Northern杂交的方法检测肺癌组织和非癌性组织,发现人肺癌组织nm23-H1基因表达明显下降用Southern杂交的方法检测52列肺癌中nm23-H1等位基因缺失，发现nm23-H1基因缺失以杂合性缺失为主,有转移的缺失率明显高于无转移的,在乳腺癌，肝癌，胃癌，恶性黑色素瘤，卵巢癌中其表达也与抑制肿瘤转移相关 nm23-H1的发现为人类探索肿瘤转移发生的细胞分子生物学机制研究开辟了一条新的途径为肿瘤转移在预防和转移的基因治疗研究方面

38、提供了线索,KAI1基因,KAI1是继 nm23-H1 后发现的又一个肿瘤转移抑制基因1995年在人前列腺癌细胞的第1号染色体中分离到 KAI1定位于染色体11p11.2区带，由10个外显子组成编码细胞膜糖蛋白具有充当调节黏附生长、分化、迁移运动的大分子蛋白质复合物的组织者的功能.,KAI1基因,KAI1基因与肿瘤的转移呈负相关,其表达降低可促进肿瘤的侵袭和转移(肝癌乳腺癌胰腺癌黑色素瘤结肠癌喉癌和肺癌)KAI基因在肿瘤中的异常表现为基因突变，等位基因缺失和表达水平的改变它的功能与信号转导、细胞与细胞之间的作用、细胞与细胞外基质之间的作用、细胞的活化与增殖有关，可能从多个方面抑制肿瘤转移,但具

39、体机制仍有待阐明。,肿瘤相关病毒的分子生物学,人类的肿瘤20%与病毒有关,DNAvirus,与动物或人类肿瘤有关的致瘤性DNA病毒：,病毒的核心是由DNA和蛋白质组成的复合体,乳头瘤病毒科(Aapillomaviridae):人乳头瘤病毒(HPV),腺病毒科(Adenoviridae):所有型别的腺病毒,疱疹病毒科:Epstein-Barr病毒(EBV),嗜肝病毒科(Hepadnaviridae):乙型肝炎病毒类(HBV),痘病毒科(Poxviridae):Shope纤维瘤病毒 多瘤病毒科(Polyomaviridae):猴病毒40(SV40),共同特征：,retrovirus,RNAviru

40、s,RNA病毒致癌的机理(一),致癌基因直接引起肿瘤：急性转化型反转录病毒感染病毒细胞后,可以将致癌基因整合到细胞基因组内,可能从病毒致癌基因转录mRNA，翻译癌基因产物（如蛋白激酶），修饰并活化细胞的某些蛋白，导致细胞转化克隆增殖形成恶性肿瘤Rous肉瘤病毒的癌基因v-src,特点:1.病毒不仅在感染动物致瘤，而且可以使体外培养的细胞发生恶性转化2.病毒感染细胞并表达癌基因的时间短，为急性转化3.病毒感染细胞后导致转化的频率较高4.产生的肿瘤为多克隆性.,RNA病毒致癌的机理(二),整合作用引起肿瘤：病毒自身并不带癌基因，而是通过整合插入细胞基因组中，激活邻近的细胞原癌基因而导致肿瘤。小鼠乳

41、腺肿瘤病毒(MMTV)不含v-onc，但是当其插入宿主基因组后，它的调控序列能激活毗邻的宿主癌基因,特点:1.不能在体外培养中转化细胞2.病毒致瘤效应的潜伏期很长,数月数周3.产生的肿瘤为单克隆,逆转录病毒与细胞癌基因活化RNA病毒 原癌基因结构异常 癌变,随机插入,protein1,protein2,DNA病毒的致癌机理,DNA肿瘤病毒是通过同细胞的癌基因或抑瘤基因的相互作用而破坏细胞的正常生长 1.病毒DNA与宿主细胞DNA通过重组而激活某些原癌基因 2.病毒编码的蛋白产物结合到宿主抑癌基因蛋白产物上，并使后者失活而发挥作用,DNA病毒连接到细胞蛋白,肿瘤病毒学研究对分子肿瘤学发展的贡献,

42、癌基因的发现直接来源于对RNA肿瘤病毒的结构和致癌机理的探索(Rous肉瘤病毒)对抑癌基因的认识直接受益于DNA肿瘤病毒致癌机制的阐明(SV40的大T抗原,Adv的E1A)肿瘤病毒学的发展将推动肿瘤发生的分子生物学研究,总结,几乎所有的肿瘤都有一个根本的共同特征,细胞周期调控机制的破坏,导致细胞的失控性生长绝大多数癌基因抑癌基因不能直接引起肿瘤,几乎所有癌基因和抑癌基因的功效,最终都从不同的途径汇聚到细胞周期的机制上来,许多癌基因抑癌基因直接参与细胞周期的调控,或本身就是细胞周期调控的主要成分,肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机制破坏的疾病,(cell cycle disease),肿瘤的发生源于

43、遗传物质DNA 的改变 这种改变是多步骤完成的多个基因变化的细胞进化过程 不仅癌基因之间有协同作用，癌基因与抑癌基因之间也存在协同作用,肿瘤作为一种复杂的多基因疾病，用单基因的特征是难于解释肿瘤的全部发病机理 从多基因的角度探讨基因的变化规律是当前研究肿瘤发病机制的关键切入点,cDNA微矩阵基因芯片技术：不但可以高敏感度地定量定性检测基因的表达水平，而且还可同时研究同一组织或不同组织中成千上万个基因的表达，改变了Northern blot RT-PCR 仅对单个或几个基因表达水平检测的局限蛋白质组技术：,将来的应用,肿瘤的分子诊断：可从分子水平上的标记来确定癌症的存在与;否;可以作为肿瘤诊断的早期指标;可作为判断患者愈后的分子指标肿瘤的分子治疗：将正常的抑癌基因导入癌细胞中重建抑癌基因的功能,将反义基因导入肿瘤细胞中,抑制癌基因的表达,Thanks for Your Attention!,