种质离体保存.ppt

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1、7 种质离体保存,种质：亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。种质保存主要有两种方式：原地保存和异地保存。离体保存：将组织培养中的外植体或试管苗储存在使其抑制生长、缓慢生长或无生长的条件下，以达到长期保存的目的。,7.1 常温保存 在2025度长温下，通过改变培养基中某些营养物质的浓度，改变培养的环境条件，从而达到种植保存的目的。,7.2 常低温和低温保存常低温：0 15度；低温：80 0度。根据不同植物对低温的耐受力确定其抑制生长的保存温度；在低温保存时可结合低温来取得更好的效果。,7.3 超低温冷冻保存种质 超低温保存也叫冷冻保存，在196度的超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的

2、状态。,7.3.1 超低温冷冻保存种质的方法超低温保存:将离体培养的茎尖分生组织、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体经冷冻防护剂处理后放入196度的液氮罐或库中保存。常用的冷冻防护剂：甘油、甘露醇、脯氨酸、二甲基亚枫，使用浓度5%10%。,7.3.2 超低温冷冻保存种质 的原理(1)冷冻防护剂属于低分子中性物质，与水溶液发生水合作用而增加黏度，使溶液冰点下降；(2)使用冷冻防护剂可提高培养基的渗透压，导致细胞发生轻微质壁分离，从而提高组织和细胞的抗寒力；(3)二甲基亚枫还易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时因过度脱水而遭破坏。,7.3.3 超低温冷冻保存种质的程序(1)预培养(2)冷处理(3

3、)降温冷冻及超低温保存(4)解冻(5)再培养(6)生活率及成活率测定,7.3.4 超低温冷冻保存种质 的应用前景,8.植物遗传转化,植物遗传转化指将外源基因转移到植物体内并稳定地整合表达与遗传的过程。遗传转化方法主要有:农秆菌介导法、基因枪法、电击法、聚乙二醇法等等。,8.1 植物遗传转化的受体系统概念：指用于基因转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，转化选择对抗生素敏感的再生系统。选择和建立良好的植物受体系统是遗传转化能否成功的关键因素之一。,8.1.1 原生质体受体系统原生质体受体系统有5个方面的特点:,8.1.2 愈伤组织受体

4、系统 愈伤组织是植物基因转化常用的受体系统之一,该系统的特点表现有五个方面。8.1.3 种质系统种质系统：以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。种质系统表现为3个方面的特点。,8.1.4 胚状体受体细胞8.1.5 直接分化芽受体系统 直接分化芽指外植体细胞进行组织培养时,越过愈伤组织阶段而直接分化形成的不定芽。,8.2 农杆菌介导的植物基因转 化技术研究表明:根癌农杆菌细胞中存在一种Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主植物基因组中，与宿主植物基因组一起表达。整合到宿主植物基因组的Ti质粒DNA片段携带有生长素、细胞分裂素和合成冠瘿碱等基因。从而使被根癌农杆菌侵染

5、过的植物组织产生冠瘿瘤，并大量合成冠瘿碱。,冠瘿碱又反过来促进根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，扩大侵染范围。这是自然界存在的天然植物基因转化系统。,8.2.1 Ti质粒的结构和功能Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子,长约200kb,平均周长54.175.4微米。结构：Ti质粒上有二个主要区域：即T-DNA区域和vir区域。Ti质粒上还具有质粒复制起始位点和冠瘿碱分解代谢酶基因位点。,8.2.2 Ti质粒载体系统 Ti质粒是植物基因工程的一种有效的天然载体,但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体却存在一些缺陷。,8.2.3 Ti质粒介导的遗传转化方法（1）叶盘法 方法:

6、将实验材料切成25mm的圆形小片(叶盘)，放入工程农杆菌培养液中浸泡45min，使根癌农杆菌侵染叶盘。再用滤纸吸干叶盘上的多余菌液，将经处理的叶盘放在培养皿的滤纸上培养2d后，再转移到含适当抗生素的培养基上继续培养及接种。特点：有很高的重复性，便于大量常规地培养转化植物。,操作步骤如下：无菌受体材料的选择 受体材料预处理 供体菌株培养 侵染,共培养 选择培养 继代与生根培养 抗性再生幼苗的移植,转基因蓝玫瑰,转基因荧光鸡,转基因荧光猪,（2）原生质体共培养转化法特点:所得到的转化体不含嵌合体,一次可以处理多个细胞,能获得较多的转化体。,（3）整株感染法 用刀切或针刺等方法在幼嫩植株上造成伤口，

7、将含有重组质粒的根癌农杆菌直接涂抹在植物伤口，从而进行遗传转化的简单易行的方法。,8.2.4 发根农杆菌Ri质粒介导的基因转化发根农杆菌从植物伤口入侵后不是诱发植物细胞产生冠瘿瘤,而是产生许多不定根,不定根迅速生长，不断分枝成毛状。研究表明：发状根的形成是由存在于发根农杆菌细胞中的Ri质粒所决定的。,（1）Ri质粒及Ri质粒载体Ri质粒与Ti质粒相似，均属于巨大质粒，其大小为200800kb；均含有T-DNA和Vir区，具有较高的同源性。（2）发根农杆菌基因转化的方法,8.3 DNA直接导入的遗传转化 技术 DNA直接导入的遗传转化技术指不依赖于农杆菌载体和其他生物媒体,将特殊处理的外源目的基因直接导入植物细胞，而实现基因转化的技术。,DNA直接导入分为化学法和物理法两类（1）PEG介导的遗传转化（2）基因枪法,