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1、1,猪链球菌2型感染动物模型研究进展,Progress on Infection Animal Models of Streptococcus suis Serotype,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医学Seminar报告,报告人：兰未未时间：,2,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,主要内容,3,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,猪链球菌(Streptococcus suis，SS)属革兰氏阳性兼性厌氧菌，是重要的人畜共患病病原体，根据其荚膜多糖抗原可将其分为35个血清型（即1-34型和1/2型）。对猪致病性较强的是1型（SS1）、2型（SS 2）、7

2、型（SS7）和9型（SS9），其中以2型流行最广、致病性最强。,1.1 猪链球菌,4,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,该病自1951年最早在荷兰发现，1954年在英国从暴发败血症、脑膜炎和关节炎的乳猪体内分离得到该型菌株，此后在澳大利亚、美国、丹麦、泰国、新加坡、加拿大及欧洲和北美洲等20多个国家导致猪群发病；1968年在丹麦首次发现人感染该菌。在国内，1990年在广东省首次发现该型菌株，后来相继在华南、西南、华东等地区分离到该菌株。2005年7月四川省资阳、内江等地暴发猪链球菌2型病，四川省累计报告人感染206例，其中死亡38例，在此期间，猪发病死亡647头。,1.2

3、猪链球菌2型,图1 SS2型血琼脂溶血,图2 SS2细菌形态(1000),5,动物医学院预防兽医系Seminar报告,甘肃农业大学,1.3 试验目的,动物模型在细菌病原学研究方面起着重要的作用，它不仅可作为判断菌株毒力的标准,也可用于研究致病机理。目前，对SS2毒力因子的研究尚不够深入，而且SS2在体内的致病机理和动态分布也不十分清楚，影响了该病的防控。因此，建立良好的动物模型,对研究SS2的致病机理、SS2与宿主间的相互作用及研发防治SS2感染的疫苗和药物都有着十分重要的意义。,6,动物医学院预防兽医系Seminar报告,2.动物模型,目前，已有研究的SS2的感染模型有：2.1小鼠模型 2.

4、2豚鼠模型 2.3斑马鱼模型 2.4兔模型 2.5仔猪模型 2.6小型猪模型,甘肃农业大学,7,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,Williams等首先发现从病猪分离的SS2能引起小鼠发病，且仔鼠比成年鼠更易发病，感染后42天仍可从小鼠体内分离到病原菌。Kataoka等研究发现C57BL/6、ICR及ddY小鼠与BALB/C小鼠相比对SS2的敏感性偏低。另外，对菌株致病力进行研究时，人们发现虽有个别试验显示同一菌株对猪和小鼠的致病性相同，但多数试验结果表明两者并不完全一致，尤其是猪的弱毒或无毒菌株，对小鼠常表现较强的致病力和死亡率，这表明SS2存在种属特异性。,2.1 小鼠

5、模型,8,动物医学院预防兽医系Seminar报告,甘肃农业大学,综上所述，小鼠作为试验动物虽然具有遗传背景清楚、个体差异小、易饲养等优点，但是由于SS2对猪和小鼠致病力上存在差异，以小鼠建立的SS2模型只适合作疫苗免疫效力等的研究，并不适合做SS2毒力因子和致病力等研究。,2.1 小鼠模型,9,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,2.2豚鼠模型,吴全忠等用SS2江苏分离株HA9801感染豚鼠，建立猪脑膜炎、败血症动物模型。结果显示16-24日龄的豚鼠最易感染该菌，皮下接种比腹腔和鼻腔接种更易感，更易患脑膜炎。该菌株对豚鼠的半数致死量为5.5106CFU，接种豚鼠出现耳廓红斑以

6、及跛行、运动失调等神经症状，死亡豚鼠各实质脏器充血并发生炎症，出现脑膜及脑组织不同程度的水肿和炎症，半数可见淋巴细胞、单核细胞及嗜中性白细胞浸润等，这与仔猪试验感染和自然发病情况一致。,10,动物医学院预防兽医系Seminar报告,甘肃农业大学,2.2 豚鼠模型,研究发现，皮下和鼻腔接种豚鼠都能引起菌血症。在各脏器组织中都可分离到病原菌，但只有出现神经症状时，才能从脑脊液和脑组织中分离到细菌，说明细菌突破血脑屏障是患脑炎的病因，这为探讨该病的致病机理奠定了基础。另外，试验结果还表明，豚鼠同群感染时间比仔猪晚，证明豚鼠的易感性低于仔猪，但该试验未证明SS2对豚鼠和猪的致病力完全一致，且目前国内外

7、此类的相关报道较少，需要进一步的证实。,11,动物医学院预防兽医系Seminar报告,甘肃农业大学,2.3 斑马鱼模型,Jesse D.M等首创以斑马鱼为模型研究海豚链球菌和化脓链球菌的致病机理。濮俊毅等用江苏分离株HA9801#腹腔接种斑马鱼，建立SS2感染动物模型。接种HA9801#的斑马鱼12h以后陆续出现病变，肛门周围和腹部出现块状充血。剖检观察到，肝脏呈现苍白色，腹腔内有较多积水，具有典型的细菌性败血症病理变化。96h内对斑马鱼的半数致死量(LD50)在5.361045.01104CFU之间。从接种HA9801#菌株病死的斑马鱼体内能重新分离到该病原菌。实验结果表明，斑马鱼可作为研究

8、SS2菌株感染的动物模型。另外，斑马鱼有着较为完善的免疫体系，而且体型小，方便实验室养殖和开展大规模的试验。,12,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,2.4 兔模型,有学者从流行病学研究表明，SS2虽可感染兔，但其发病率和死亡率极其不规律，故认为兔不适合做SS2感染模型。但王继春等研究认为SS2对猪和兔的致病力与其毒力因子表现型关系密切。表型为MRP+（溶菌酶释放蛋白）、EF+（胞外因子）、SLY+（溶血素）的SS2对猪和兔都有很强的致病力，但对BALB/c小鼠不致病。因此，他认为兔可以作为SS2感染模型。鉴于此尹铁勇（2008）研究了SS2中国强毒流行菌株(458#)、S

9、S2中国弱毒分离株(5#)以及SS2国际参考无毒菌株(1330#)在家兔感染与免疫上的作用。,13,图3 肺严重出血、表面有大量血斑,图5 心脏出现弥漫性血管内凝血,图4 脑膜血管充血,图6 肝小叶间静脉、中央静脉有血栓形成,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,实验结果表明，SS2强毒株(458#)接种家兔，可以复制出与猪自然感染相类似的临床症状和特征性病理组织学变化，并可引起兔败血性死亡，其特征性病理组织学变化是多器官的DIC和微血栓的形成。而SS2中国弱毒分离株接种家兔，仅仅引起低烧、沉郁等非常轻微的临床症状，并不引起家兔死亡，个别器官有时可出现轻微的 DIC。,14,甘

10、肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,另外，利用SS2国际参考无毒菌株(1330#)对家兔所进行的免疫学研究中，该无毒菌株不引起家兔发病，动物大体解剖未见病理变化，病理组织学观察亦无明显的组织病理变化，这与国外利用猪所做的感染实验结果一致。该国际参考无毒菌株皮下接种家兔，可见接种动物的脾小体增大和淋巴细胞密集，诱发机体产生高水平的特异性血清抗体。,综上所述，尹铁勇认为家兔可以作为研究猪链球菌病以及评价SS2毒力强弱的动物模型，也可以作为SS2疫苗效果评价的动物模型。,图7 脾小体增大、上皮样细胞活化,图8 脾脏髓质中淋巴细胞密集,15,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Semin

11、ar报告,2.5 仔猪模型,建立SS2对仔猪的感染模型时,根据试验目的的不同,采用的感染途径也不尽相同。由于自然状态下SS2可经母猪、环境(饲料、昆虫等)、损伤及空气传播，故试验中常模拟SS2的天然感染途径进行接种（即呼吸道接种、口腔胃肠道接种和静脉接种）。,16,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,2.5.1 呼吸道接种,Vecht等预先用败血波氏杆菌接种新生无菌仔猪，再用SS2通过鼻腔接种感染成功，但这种方法重复性差。冯文海等先将猪繁殖呼吸综合症病毒(PRRSV)弱毒株注射实验动物，5天后再鼻腔接种SS2，发现PRRSV可以降低免疫力，从而使仔猪对SS2易感。,17,甘肃

12、农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,王建等用PRRSV弱毒株和SS2联合静脉接种仔猪的方式建立感染模型。结果显示，联合感染组仔猪出现跛行，食欲减退甚至废绝，呼吸急促并伴有抽搐、滑水样运动等神经症状，且在5天内全部死亡。剖检见脑膜出血、血液凝固不良、淋巴结出血、肺出血水肿、肝淤血和关节囊液有透明液体等变化。Madsen等为模拟SS2天然感染，建立气雾感染模型。先将仔猪暴露在气雾酸化环境一段时间后，再改用菌雾环境。结果发现，在发病和亚临床感染仔猪的扁桃体中能分离到SS2，发病仔猪的腭淋巴结中也能检测到SS2。由此可知，SS2是先感染扁桃体，然后随淋巴扩散。,18,甘肃农业大学,动物医

13、学院预防兽医系Seminar报告,Andreas Beineke等也用SS2鼻腔接种建立感染模型，仔猪出现发热和白细胞增多等临床症状，严重的出现震颤、共济失调、角弓反张等神经症状，发病率为5/6，死亡率为4/6。Florence Berthelot-Herault等认为猪链球菌可通过空气传染。他将接种2型菌的仔猪与空白对照组在同一圈舍内分开饲养，两组之间相距40cm。第7天在空白对照组仔猪的腭扁桃体内可分离到2型菌，并表现出与感染组相似的临床症状。,19,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,2.5.2 口腔胃肠道接种,Lun等先将菌液雾化，然后再感染咽部建立仔猪感染模型，研究

14、溶血素的毒力作用。结果发现断奶仔猪的临床症状比较明显。这可能是肠道粘膜酸化增大了肠道大分子的穿透性，在应激条件下，消化道防御功能减退，细菌容易通过胃转位感染脏器。Salles等采用扁桃体喷菌液的方式感染仔猪，感染18h之后，含免疫球蛋白-轻链的细胞数增加，18h和48h时最明显。CD4+和CD8+细胞在24h和72h时最多。巨噬细胞和中性粒细胞也随着增多。赵云岭等灌胃接种感染仔猪发现口服组发病最晚，临床症状相对轻，死亡率偏低。,20,动物医学院预防兽医系Seminar报告,甘肃农业大学,2.5.3 静脉接种,2001年Herault等采用7周龄的SPF仔猪，建立了静脉注射感染模型。试验对法国分

15、离的3个菌株进行了比较，研究结果显示不同毒力的菌株引起的临床症状明显不同，并且试验的重复性较好。他们认为在其试验中建立的动物模型,对于研究其它SS2的毒力是一个很好的工具，可以用此评估毒株的毒力。2005年Herault等又用此模型对加拿大分离株89-1591进行了毒力评估。结果显示，感染89-1591#的仔猪出现跛行、多数出现关节肿胀，而且还出现角弓反张、共济失调等神经症状。该试验结果证明静脉注射也是一种较好的接种途径，适合动物模型的建立。,21,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,2.6 小型猪模型,王姝优等用SS2四川分离株ZY05719#肌肉注射感染，肌注浓度为110

16、9CFU/ml。结果发现，感染ZY05719#的动物出现食欲减退、体温上升、不能站立、呼吸困难及抽搐等临床症状；剖检可见猪体型消瘦，脾淤血、肺淤血、肾脏淤血，肠系膜淋巴结肿大、出血等病理变化，与其临床发病表现很相似。,图9 肠系淋巴结肿大,图10 脾脏淤血,22,动物医学院预防兽医系Seminar报告,甘肃农业大学,并且可从心脏和脑、脾、肝脏、肾脏等组织脏器都能检测到该病原菌。扁桃体中分离到SS2证实了扁桃体是SS2的定殖器官；只有出现神经症状且死亡的小型猪，才能从脑脊液和脑组织中分离到SS2，说明细菌突破血脑屏障是引发脑膜炎的病因。这为SS2感染性脑膜炎导致死亡提供了研究依据。综上，SS2感

17、染SPF小型猪中后，可表现出与自然发病相似的临床表现，且重复性好，又由于该动物体型小，方便操作，很适合用于SS2的毒力和致病机理的研究。,23,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,3.1 讨论,目前，国内外对SS2已经做了大量的研究工作，研究中人们发现该菌的动物致病性比较复杂，不同动物对同一菌株的毒性反应也不同。建立通用、公认的动物模型对SS2菌株毒力机制和疫苗的研究显得尤为重要。,3.讨论与展望,24,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,各类SS2的动物感染模型各有特色，关于动物模型的选择至今尚未有定论。,仔猪和小型猪动物模型，虽然能更真实反映天然感染条件

18、下的临床症状和病理改变，但在操作性和经济性等方面存在不足，且需要根据不同的实验目的选择不同的感染途径；小鼠模型虽然从来源、饲养条件、经济等方面更适用，但需考虑SS2感染时种属特异性和稳定性等因素的限制；而豚鼠模型和斑马鱼模型的可重复性和应用范围还需进一步验证；只有家兔可以复制出与猪自然感染相类似的临床症状和特征性病理组织学变化，不但可用于研究猪链球菌病以及评价SS2毒力强弱的动物模型，也可以作为SS2疫苗效果评价的动物模型。,25,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,总之，不断研究和改良出更好的SS2感染动物模型，真实地反映SS2天然感染状态下的病理生理改变与临床过程，以便更

19、好地研究其致病机制、毒力相关因子及研发出良好的免疫疫苗与治疗用药，是医学及兽医科研工作者仍需继续努力的方向。,3.2 展望,26,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,Thanks for Your Attention!,27,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,28,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,29,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,30,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,31,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,32,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,33,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,34,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,35,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,36,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,37,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,38,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,39,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,40,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,41,甘肃农业大学,动物医学院预防兽医系Seminar报告,