真核基因组DNA提取.ppt

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1、真核基因组 DNA提取,教学内容,真核生物基因组的结构及特点、人类基因组计划真核基因组提取的实验原理、操作说明、仪器使用及注意事项基因组提取后的应用：基因组文库、PCR及southern blotRNA提取方法简介核酸（DNA和RNA）定量及定性方法的介绍,实验目的,熟悉真核DNA提取的方法和原理掌握真核生物基因组的结构及特点,分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等）。核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分

2、子的污染。,核酸制备的一般原则,尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）。,核酸制备时应注意的事项:,核酸制备的步骤：,核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于RNA，因分子较小，不易被机械剪切力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如

3、0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制 操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,核酸制备中常用的去垢剂用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂

4、的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,核酸提取的一般过程,2）破碎抽提核酸除去杂质 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离 2使核酸与蛋白质分离 3除去

5、脂类 4多糖的除去,核酸提取的一般过程,3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,核酸提取的一般过程,4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度：4 最佳和最简单-70是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存 保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,核酸提取的一般过程,注意事项材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DN

6、A降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,注意事项细胞裂解,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,注意事项核酸分离纯化,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发若长期储存建议使用TE缓冲液溶

7、解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,注意事项核酸沉淀、溶解,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对策,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在

8、解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,问题二：DNA降解,对策,原因,DNA提取常见问题,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,对策,原因,DNA提取常见问题,实验

9、原理,想要制备基因组DNA，必须破碎细胞膜，去除蛋白质、脂类和糖类等生物大分子且避免被细胞内核酸酶降解即保证DNA的完整性。,在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，将分散好的真核生物组织、细胞用蛋白酶K消化真核细胞或组织并分解蛋白质，用SDS溶解细胞质并使蛋白质变性从而与DNA分子分离，使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。DNA在高盐低pH的条件下，与硅基质膜特异性结合，在低盐高pH值条件下，吸附的DNA被洗脱下来。,实验步骤,处死小鼠，取肝脏20-50mg，剪碎，加入1.5mL离心管内,加入600 L Lysis Buffer A，振荡混匀,加入10 L 蛋白酶 K，60

10、 水浴1h，其间颠倒混匀数次,1.裂解组织细胞，变性蛋白，沉淀生物大分子,组织块尽量剪碎，否则影响裂解及消化,主要含有SDS（溶解细胞质并使蛋白质变性）EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）和Tris-HCl（缓冲体）,消化降解蛋白质,离心5 min，将上清转入离心柱中，静置2 min,加入10 L RNase A，混匀，室温放置10 min,加入400 L Lysis Buffer B，剧烈震荡30 s,核酸内切酶、去除DNA制品中的污染RNA,沉淀作用，内含有醋酸，提供低pH环境,上清可能出现少量白色漂浮物，此为未消化完全的细胞和蛋白质,2.DNA吸附在硅基质膜上，清洗去除盐等杂质,1

11、2,000 rpm离心1 min，弃废液,加入700 L Wash buffer A，12,000 rpm离心 1min，弃废液,加入700 L Wash buffer B，12,000 rpm离心1min，弃废液,加入500 L Wash buffer B，12,000 rpm离心1 min，弃废液,再次12,000 rpm离心2 min，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37 恒温箱放置510min，直至无明显乙醇味,Wash buffer A（含60%的乙醇）Wash buffer B（含80%的乙醇）主要去除盐等杂质,3.洗脱DNA,在硅基质膜中央加入50 L Elut

12、ion Buffer（EB）(事先预热5565)置于室温2 min12,000 rpm离心2 min所得液体即为基因组DNA溶液。,Elution Buffer（EB）：主要是TE buffer,提供高pH值环境，使吸附的DNA被洗脱下来,注意事项,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。由于真核生物基因组较大，操作时应注意轻柔，最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。,实验结果,核酸（DNA及RNA）的鉴定及定量紫外分光光度法琼脂糖凝胶电泳法,紫外分光光度法 测定DNA的纯度和浓度,原理：DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫外光区具有较强的吸收,其吸

13、收峰在260 nm处。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染时，会影响DNA吸收光的准确测定。蛋白质在280 nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230 nm处。因此，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280 和OD230计算其比值来衡量样品的纯度。,即OD2601时：dsDNA(双链DNA)浓度约为50 g/mL ssDNA(单链DNA)浓度约为37g/ml RNA浓度约为40g/ml 寡核苷酸浓度约为30g/ml,浓度的计算,dsDNA 浓度（g/L）=OD260稀释倍数50/1000 RNA 浓度（g/L）=OD260稀释倍数40/1000,纯度的检测,DNA纯品的O

14、D260/OD280 约为1.8。OD260/OD2801.9说明含有RNA污染；OD260/OD2801.6 说明有残余的蛋白质、酚等存在。OD230/OD260的比值应在0.40.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在22.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。,琼脂糖凝胶电泳法 分离鉴定核酸的常规方法,用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷的中性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结构。,结果观察：制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子可插入DNA的碱基之间，

15、可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置（荧光条带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照。,琼脂糖凝胶制备及电泳,1、凝胶准备（0.8%）:用1TAE配制1琼脂糖凝胶。称0.8 g琼脂糖置三角瓶中，加100 mL 1TAE 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖 熔化的琼脂糖自然冷却到6070，加入荧光染料 2L，并轻轻混匀。,2、倒胶：将冷却60的凝胶缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。室温下静置20 min，凝胶凝固。拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。,3、点样：向电泳槽中加入1TAE电泳缓冲液，让液面高于胶面1mm。样品准备：吸取5 L已提取的基因组DNA点在点

16、样纸上，加入1 L 6上样缓冲液，用移液器轻轻混匀。上样：用移液器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。,上样缓冲液（loading buffer）作用：指示剂；沉降作用（含甘油），防止漂样。,4、电泳：盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。电泳条件：电压80v（恒压）；时间30 min左右（根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳）电泳结束后，切断电源，取出凝胶。5、紫外灯下观察并分析结果：紫外检测仪直接观察电源条带 摄影记录,小鼠肝脏DNA,1 2 3,实验讨论,提取后的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳后，条带弥散，分析其可能原因。,思考题,1.简述真核基因组结构特点。2.如何从动物组织中提取基因组DN

17、A，简述其原理。,提取真核基因组DNA的应用,基因组包含了某物种生长、发育、繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构组成，以及表达调控的研究至关重要。高纯度、相对完整的基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要起始步骤。,应用于,构建基因组文库southern杂交PCR技术,1.构建基因组文库,基因组DNA文库（genomic DNA library）从生物组织细胞提取出基因组DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每

18、一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体。,构建基因组文库的目的：以稳定的重组体形式保存某种生物的全部遗传信息和分离克隆有用的目的基因；染色体DNA非常复杂，单个基因所占比例十分微小，若想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因组文库。,基因组文库构建,构建基因组文库用载体,噬菌体置换型载体或黏粒载体质粒载体：小，只能用于构建叶绿体基因组文库。基本程序（1）基因的克隆（2）克隆基因的分离（3）分离基因的检测与分析分离到的基因用于：基因治疗（例如正常的人的腺苷脱氢酶（ADA

19、）基因成功植入ADA缺乏症患者的淋巴结构）、DNA疫苗（HIV-9P160核酸疫苗）、蛋白质产品（胰岛素、干扰素、生长因子等）,2.Southern blot,指将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中的标记核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的核酸分子杂交方法。由于Southern 印迹杂交的高灵敏度和高特异性，它广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。,核酸杂交:Southern blot：用于DNA分析Northern blot：用于RNA分析,3.PCR,PCR：聚合酶链式反应，可以从复杂的材料中扩增 特殊DNA序列的强有力的技术。

20、用采用特意引物的PCR直接从基因组DNA中分离基因。缺点：由于PCR酶的持续合成能力的不足和校正能力的缺陷，仅对较短产物的扩增有效（5Kb）。,总RNA的提取,提取RNA实验的关键 _严格防止RNase的污染,核糖核酸酶(RNase):催化降解RNA为小分子片段的核酸酶,无处不在,体内：取材要新鲜或液氮保存；破碎细胞要快，尽量在低温下进行,体外：空气、试剂、耗材及实验者本身,体外RNAase的去除,所用的各种器皿：将玻璃器皿、离心管、吸头等浸泡于0.1%DEPC溶液中37下处理12 h，121高压灭菌30 min，再烘干。配溶液时所用的超纯水需DEPC处理，即0.1%DEPC溶液配制后37放置

21、12 h，121高压灭菌30 min；尽可能用未曾开封的试剂。实验者本身：戴一次性干净手套、口罩，避免外界环境中RNA酶降解RNA。仪器：70%乙醇拭擦。,RNA提取原理,商业化试剂盒（RNAiso plus试剂、TRIzol reagent）中含有强变性剂（如异硫氰酸胍），能够充分裂解细胞，溶解蛋白质，使核蛋白与核酸分离。再加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机下层（含有蛋白质、多糖、脂肪酸、细胞碎片和少量DNA），RNA存在于上清层中。小心收集上清层后，经异丙醇沉淀即可回收得到总RNA。,高纯度的RNA，适用于Northern blot分析、mRNA纯化、RT-PCR和体外翻译等分子生物学实验。,注意,1.RNA浓度:RNA(mg/mL)=OD260稀释倍数40/1000。2.RNA的纯度：OD260/OD280 的比值在1.72.1较好，比值较低，说明含有蛋白质污染；比值太高，提示RNA有降解。,3.RNA电泳 可能是两种rRNA(28s和18s)，条带亮度比例约2:1。条带弥散，说明RNA可能已降解。若条带大小大于28s，则可能有基因组DNA的污染，用DNase I处理DNA污染较好。,