生物技术与食品安全检测.ppt

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1、第一节 新进展概述第二节 生物传感器技术与应用第三节 生物芯片技术与应用第四节 免疫技术及其应用,第七章 生物技术新进展 与食品安全和质量检测,第二节 生物传感器与食品安全检测,1 生物传感器的基本概念,生物传感器通常是指由一种生物敏感部件和转化器紧密结合,对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。它是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控方法,也是对食品质量在分子水平上进行快速和微量分析的方法。,生物传感器工作原理,待测物质经扩散作用进入固定生物膜敏感层，经分子识别而发生生物学作用，产生的信息如光、热、音等被相应的信号转换器变为可定量和处理的电信号，再经二次仪表放大

2、并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的量或浓度。,.1 将化学变化转变成电信号,如酶传感器,酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量有所增减。用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合,即组成酶传感器,常用转换装置有氧电极、过氧化氢。,2.2 将热变化转换成电信号,固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化。例如大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围.这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中。,.将光信号转变为电信号,例如，过氧化氢酶,能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光,因

3、此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端,再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量.还有很多细菌能与特定底物发生反应,产生荧光.也可以用这种方法测定底物浓度.,上述三类传感器原理的共同点：都是将分子识别元件中的生物敏感物质与待测物发生化学反应,将反应后所产生的化学或物理变化再通过信号转换器转变为电信号进行测量,这种方式统称为间接测量方式.,.4 直接产生电信号方式,这种方式可以使酶反应伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接(或通过电子递体的作用)在电极表面上发生。根据所得的电流量即可得底物浓度。,生物传感器发展历程,开端于 20 世纪 60 年代。1962 年克拉克等人报道了用葡萄

4、糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果,可认为是最早提出了生物传感器(酶传感器)的原理。1967年Updike等人实现了酶的固定化技术,研制成功酶电极,这被认为是世界上第一个生物传感器。,20世纪70年代中期后,生物传感器技术的成功主要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等研究,并获得了较快的进展。1977年,钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)进行快速测定的微生物传感器的报告,正式提出了对生物传感器的命名。,生物传感器分类,4.1 根据传感器输出信号的产生方式,可分为生物亲合型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器;*4.2 根据生物传感器的信号

5、转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等 4.3 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。,每一类名称又都包含许多种具体的生物传感器例如，酶电极类:根据所用酶的不同就有几十种，如葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、乳酸电极、丙酮酸电极等等葡萄糖电极也并非只有一种，有用pH电极或碘离子电极作为转换器的电位型葡萄糖电极，有用氧电极或过氧化氢电极作为转换器的电流型葡萄糖电极等实际上还可再细分。,生物亲合型传感器 被测物质与分子识别元件上的敏感

6、物质具有生物亲合作用，即二者能特异地相结合，同时引起敏感材料的分子结构和/或固定介质发生变化。例如：电荷、温度、光学性质等的变化。反应式可表示为：S（底物）+R（受体）=SR,代谢型传感器 底物（被测物）与分子识别元件上的敏感物质相作用并生成产物，信号转换器将底物的消耗或产物的增加转变为输出信号，这类传感器称为代谢型传感器，其反应形式可表示为 S（底物）R（受体）=SR P（生成物）,生物传感器优点：,由于具有较高的选择性，因此不需对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的生物传感器，非常有利干食品质量的市场快速评价；,可以实现连续的在线检测，使食品

7、加工过程的质量控制变得简便；响应速度快，样品用量少；与其他大型分析仪器相比，生物传感器的制作成本低，且可反复使用。,6 生物传感器组成部分,一 是生物分子识别元件(感受器),是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等);二 是信号转换器(换能器),主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等,从而达到分析检测的目的。,（一）生物识别元件,它是酶、抗原(体)、细胞器、

8、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力.,（二）换能器,它能将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，在一定条件下，产生的电信号强度和反应中物质的变化量或光、热等的强度呈现一定的比例关系。,换能器(信号转换器)将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可用信号生物传感器的信号转换器已有许多种，其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是电化学电极，用它组成的生物传感器称为电化学生物传感器,（三）信号处理放大装置,主要负责信号的分析处理和放大输出。它能将换能器产生的电信号进行处理、放大和输出。,

9、手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,6.2 传感器类型(1)酶传感器(EnzymeSensor),酶的活力单位（酶单位）,标准酶单位 国际生物化学协会酶委员会规定了酶单位的标准形式为：一个酶单位（U）是在特定的条件下lmin内催化形成1mol产物的酶量（或转化1mo1底物的酶量）特定条件一般是指选定的条件，如温度为25，30，37，最适pH,底物为饱和溶液,酶传感器,它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。1967年Updick和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极；此后,这类酶传感器通常是通过检测产物H2O

10、2的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。,葡萄糖电极缺点:(1)溶解氧的变化可能引起电极响应的波动;(2)由于氧的溶解度有限,当溶解氧贫乏时,响应电流明显下降而影响检测限;(3)传感器响应性能受溶液pH值和温度影响较大,依据信号转换器的类型,酶传感器大致可分为酶电极(主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极)、酶场效应晶体管传感器(FET-酶)和酶热敏电阻传感器等,(2)组织传感器(TissueSensor),组织传感器是以动植物组织薄片中的生物催化层与基础敏感膜电极结合而成,该催化层以酶为基础,基本原理与酶传感器相同.与酶传感器比较，组织传感器具有如下优点：1.酶活性较离析酶高.

11、2.酶的稳定性增大.3.材料易于获得.,肝组织电极 动物肝组织中含有丰富的H2O2酶，可与氧电极组成测定H2O2及其它过氧化物的组织电极1981年Mascini等研究了数种哺乳动物和其它动物（鸟、鱼、龟）的肝组织电极，翌年，报道了基于牛肝组织的H2O2电极,若向溶液中通以氮气，以降低氧的溶解度，减少空气平衡溶液中氧的残余电流（约10A）至十分之几微安，检测下限可降低至1X10-5molL，相关系数 R=0.997(n9),植物组织膜电极结构图解 b一果皮,c-中果皮,d-内果皮1-中果皮组织薄片2-固定化骨架3-透气健,4-垫圈5-内电解质6-复合PH电极7-塑料电极体二氧化碳气敏电极结构,(

12、3)微生物传感器,微生物传感器分为两类：一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。,装置：由适合的微生物电极与氧电极组成。原理：利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物浓度的目的.,例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时,均消耗溶液中的氧,因此可用氧电极来测定基于不同类型的信号转换器,常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型，,(4)核酸传感器,依据生物体内核苷酸顺序相对稳定,核苷酸碱基顺序

13、互补的原理而设计出核酸探针传感器,即基因传感器。基因传感器一般有1030个核苷酸的单链核酸分子,能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸分子。根据换能器种类不同可分为电化学型、光学型、压电免疫传感器及表面等离子体共振型基因传感器，这种传感器可用于检测食品中的病原体,为食品中病原体的鉴定提供了新的手段。,7 生物传感器的应用,在食品分析中的应用在发酵工程中的应用在环境监测中的应用在生物医学上的应用在军事上的应用,7.1在食品分析的应用,食品成分分析食品添加剂的分析农药和抗生素残留量分析微生物和生物毒素的检验食品鲜度的检测,（一）食品鲜度的测定1、鱼鲜度传感器 鱼鲜度传感器在日本、拿

14、大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸、鲜度可用K值表示：,K=肌苷+次黄嘌呤/(ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黄嘌呤+尿酸)当K20时，鱼极新鲜，可供生食。K在2040之问为新鲜，必须熟食。K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。,由于大多数鱼死后520h，ATP，ADP 和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP-肌苷-次黄嘌呤-尿酸。基于此，Karube等催化将这3个步骤的三种酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。,2.肉鲜度传感器,肉类在腐败过程中会

15、产生各种胺类，故胺类测定也能反映肉类的新鲜程度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，测定肉在贮藏过程中的鲜度，反应时间40s，测定腐胺线性范围为0.033 10-4 molL。用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定可以猪肉新鲜度，响应时间为4min，单胺测定线性范围为502010-4 molL。,3.食品添加剂的分析,过量的食品添加剂通常会对人体造成危害，因此对食品中添加剂含量进行分析和监测是非常必要的。亚硫酸盐是常用的食品防腐剂和漂白剂，但是亚硫酸盐容易引起哮喘，因此美国FDA规定了其在新鲜水果和蔬菜等食品中的含量不得超过110-6mol/L。,Groom等人将亚硫酸氧化酶固定于

16、玻璃电极上，制成了测定亚硫酸盐的生物传感器，其灵敏度（检出下限）达到5nmol/L，线形范围为0-5mmol/L，电极在3mol/L的硫酸盐溶液中4oC保存2个月活性不变。,天冬酰苯丙氨酸甲酯，又称甜味素，是人工合成的低热量甜味剂。Guilbault等将天冬氨酸酶固定于氨电极上，制成生物传感器，其检测线性范围为。,4.污染微生物的检测,1）腐败菌的检测Matssunage等人开发出一种基于微生物在代谢过程中能产生电子，电子直接在阳极上放电产生电流，通过测定电流大小从而测定微生物浓度的传感器。用该传感器能很好地检测酿酒酵母和乳酸菌等微生物的数量,2 病原菌的检测,常见的污染食品的病原菌有沙门氏菌

17、、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌等。采用生物传感器则能迅速地测定它们的数量。用来测定病原菌的生物传感器主要是光纤生物传感器、免疫生物传感器和DNA生物传感器。,发酵罐,主机,计算机,7.2 在发酵工业中的应用-为发酵自动控制提供了新的基础平台,1)、发酵中葡萄糖测定,过去用操作繁琐时间长的还原糖方法只能近似地估计葡萄糖的变化。现在提供了快速而准确的固定化酶的测定方法，发酵中可根据糖消耗确定微生物的生长速率，观察是否染菌，随时与产物的产生一起估算转化率，确定补料效果和及时判断发酵结束的时间。发酵过程或设备异常现象通过葡萄糖分析得到及时预报。,2)、谷氨酸发酵液的

18、分析,在谷氨酸发酵中，随时跟踪目标产物的产生。快速获得主控参数的变化信息，使时间缩短了几十倍。在发酵前期及时知道产酸出现时间在发酵中期可根据谷氨酸产生速率，预知最终的产量，并获得补氨是否均匀的信息在发酵后期，可根据谷氨酸产生速率变慢情况确定放罐时间和今后配料的调整,在我国发酵工厂普及应用的谷氨酸-葡萄糖双功能分析仪,工厂发酵车间化验员正在分析样品,3、乳酸传感器在发酵上的应用,乳酸测定是生物传感器出现后新增加的控制参数。实践中发现它的控制是获得发酵高产的关键。乳酸是需氧发酵产物转化过程中的中间产物，是过程控制的敏感参数，与生物素的加入量、补糖、活菌数、菌活力、空气补给等控制直接相关。发酵旺盛期

19、，乳酸必然产生，适度的乳酸浓度是高产罐的重要指示。此时单纯地通过通风是达不到乳酸下降的目的，反而引起能源的浪费及减产。发酵后期、放罐前应控制乳酸下降，才能达到高产。,乳酸传感器的应用现状是体育上耐力项目科学训练的常用设备已在抗疲劳保健食品检测中普及应用，许多省级卫生防疫站成功地用这项新技术实现了在同一小实验动物体内多次采血检测，简化了分析化验工作量 是发酵控制的有效新指标 是新型可降解塑料聚 L-乳酸前体生产过程控制的主控参数,水质分析：一个典型应用是测定生化需氧量（BOD），传统方法测BOD需5天，且操作复杂。1977年Karube等首次报道了BOD微生物传感器，只需15分钟即能测出结果,连续使用寿命达17天；废气或环境大气的监测：可用于测定空气中SO2、NOX、CO2、NH3、CH4等的含量；农药和抗生素残留量的分析：用乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶为敏感材料制作的离子敏场效应晶体管酶传感器可用于蔬菜等样品中有机磷农药DDVP和伏杀磷等的测定,3)在环境监测中的应用,SBA-70型血糖乳酸自动分析仪,德国研发的环境废水BOD分析仪,