生物化学简明教程第四版第五章酶.ppt

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1、第五章 酶(enzyme),酶的发展历史,1837年，瑞典化学家Berzelius认为发酵是活细胞造成的，首先想到催化作用。,1857年Pasteur认为酒的发酵是酵母(yeast)细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。,1878年Kuhne提出了enzyme，源于希腊语的酵母中(in yeast)，中文：酵素 酶,1897年Buchner兄弟用不含酵母细胞的提取液完成了发酵，证明酶无生命，只是一种化学物质。,Eduard Buchner是第一位提出酵素可以独立出细胞而产生作用的，获1907年诺贝尔化学奖。,1926年Sumner从刀豆中得到脲酶的结晶，首次证明酶是蛋白质。,1930年N

2、orthrop得到胃蛋白酶结晶。,1946年Sumner和Northrop获得诺贝尔化学奖。,1965年Blake对溶菌酶进行了X-射线衍射分析，酶的活性中心的催化机理获得了直接而具体的解释。,1982年Cech发现个别RNA具有自我催化作用，提出Ribozyme的概念。,The Nobel Prize in Chemistry 1907,for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation(1897),Eduard Buchner,The Nobel Prize in Chemistry 1946

3、,for his discovery that enzymes can be crystallized(1926),for their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form,James Batcheller Sumner,John Howard Northrop,Wendell Meredith Stanley,The Nobel Prize in Chemistry 1972,for his work on ribonuclease,especially concerning the connection betwe

4、en the amino acid sequence and the biologically active conformation,for their contribution to the understanding of the connection between chemical structure and catalytic activity of the active centre of the ribonuclease molecule,Christian B.Anfinsen,Stanford Moore,William H.Stein,The Nobel Prize in

5、 Chemistry 1989,for their discovery of catalytic properties of RNA(1982),Sidney Altman,Thomas R.Cech,酶是生物催化剂。,酶的概念,酶的化学本质,绝大多数是蛋白质,后来发现有些核酸也具有催化活性,如：L19RNA，核糖核酸酶P,ribozyme：核酶,酶的催化特性,1、催化效率高；2、对环境因素敏感；3、酶的活性具有调节性;4、专一性。,酶的催化效率：比化学催化剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。,例 2H2O22H2O+O2,酶对环境因素敏感,Legume Nodules,酶作

6、用的专一性,绝对专一性,酯酶,-葡萄糖苷酶,基团专一性,胰蛋白酶的作用位点,旋光异构专一性,（反丁烯二酸）,几何异构专一性,酶的分类,1.氧化还原酶:,A+BH2,AH2+B,2.转移酶：,AR+B,A+BR,3.水解酶：,AB+H2O,AOH+BH,4.裂解酶,AB,A+B,5.异构酶,6.合成酶,A,B,A+B+ATP,AB+ADP+Pi,六大类酶催化反应的性质,1氧化还原酶类（oxido-reductases）,（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2。,2A2H+O2 2A+2H2O,A2H+O2 A+H2O2,邻苯二酚氧化酶（，邻苯二酚：氧氧化酶）,邻苯二酚,邻苯醌,

7、例：,（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢,A2H+B A+B2H,例：,乳酸脱氢酶（，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）,2转移酶类（transferases）,催化基团的转移,谷丙转氨酶（GPT）（，L-丙氨酸：酮戊二酸氨基转移酶）,3水解酶类（hydrolases）,AB+H2O AOH+BH,4裂合酶类（lyases）,从底物移去一个基团而形成双键或逆反应,AB A+B,例：,5异构酶类（isomerase）,催化异构化反应,例：,6合成酶类（synthetases,也称ligases连接酶类）,将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。,例：,酶的命名,1习惯名称（recommende

8、d name）,（1）底物：如蛋白酶，脂肪酶,（2）反应性质：如脱氢酶，装转氨酶,（3）底物和反应性质：如琥珀酸脱氢酶,（4）来源或其它特点：如胃蛋白酶,命名依据：,1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。,2系统名称（systematic name）,（1）标明底物，催化反应的性质,（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。,丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸,丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶,脂肪+H2O 脂酸+甘油,脂肪水解酶,酶的编号:,用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以EC

9、（为Enzyme Commission）。,EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1,酶的组成,1单纯酶类,2结合酶类,全酶=酶蛋白+辅因子,根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类,1单体酶（monomeric enzyme）,2寡聚酶（oligomeric enzyme）,3多酶复合物（multienzyme complex）,单体酶,只有1条多肽链的酶。,寡聚酶,由几个亚基组成的酶，亚基之间以非共价键连接。,多酶络合物,几个酶嵌合而成的络合物，这些酶功能相关，催化一系列连续的反应,活性部位（活性中心）,酶的结构与功能的关系,酶的活性中心（active center）,(binding

10、 group),(catalytic group),Glu和Asp的-COOH,组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有,Lys的-NH2,His的咪唑基,Ser的-OH,Cys的-SH,Tyr的侧链基团,Active sites may include distant residues.(A)Ribbon diagram of the enzyme lysozyme with several components of the active site shown in color.(B)A schematic representation of the primary structure of

11、lysozyme shows that the active site is composed of residues that come from different parts of the polypeptide chain.,活性中心中的基团，在一级结构中可能相距较远,必需基团,活性中心的基团都是必需基团,活性中心以外的基团呢？,Enzyme inhibition by diisopropylphosphofluoridate(DIPF),a group-specific reagent.DIPF can inhibit an enzyme by covalently modifyin

12、g a crucial serine residue,Ser195,必需基团被化学修饰的后果：乙酰胆碱酯酶,酶原的激活,胃蛋白酶原(pepsinogen)胰蛋白酶原(trypsinogen)胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen),胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活,使活性中心得以暴露出来,胰蛋白酶原的激活,3、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,Three-dimensional structure of chymotrypsin.The three chains are shown in ribbon form in orange,blue,and g

13、reen.The side chains of the catalytic triad residues,including serine 195,are shown as ball-and-stick representations,as are two intrastrand and interstrand disulfide bonds.,酶原激活的意义？,同工酶(isoenzyme or isozyme),同一种属或同一个体的不同组织或同一组织，同一细胞中存在着具有不同分子形式但却催化相同的化学反应的酶，称为同工酶。,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）,乳

14、酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）,1、组成和电泳行为,不同分子形式的同工酶催化相同的化学反应,为什么会这样？,因为它们的活性部位在结构上相同或极为相似。,酶催化作用的机理,活化分子（处于过渡态的分子）,活化能,降低反应所需的活化能,中间产物学说,E：过氧化物酶,中间络合物的证据,锁钥学说（lock and Key theory）,1894年 Fischer 提出,诱导契合学说（induced-fit theory）,1958年 Koshland提出,羧肽酶的诱导契合模式,1、邻近定向效应；2、“张力”和“形变”；3、酸碱催化；4、共价催化;5、金属离子催化。,使酶

15、具高催化效率的因素,两个反应的分子，它们反应的基团互相靠近。,邻近效应,指酶的催化基团与底物的反应基团之间的定向。,定向效应,张力效应和底物形变（strain and distortion）,酸碱催化（acid-base catalysis）,共价催化（covalent catalysis）,酶促反应速度的测定,酶促反应的动力学,测定的反应时间越长越好吗？,应该测定反应的初速度,研究影响酶促反应速度的因素,即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度,酶浓度与反应速度的关系,v,E,当S足够大时，则v=kE,底物浓度与反应速度的关系,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应

16、。,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,（米氏方程）,Et=E+ES,米氏常数的意义,当,时：,因此，米氏常数的涵义是：当反应速度为最大反应速度一半时，底物的浓度,Km是酶的一个特征性常数,只与酶的性质有关，与酶的浓度无关,当酶能催化几种不同的底物时，Km值一样吗？,如己糖激酶：以葡萄糖为底物时，km=0.15mmol/L 以果糖为底物时，km=1.5mmol/L,哪个是最适底物？,Km除了与底物类别有关外，还与哪些因素有关？,pH,温度,但与酶的浓度和底物浓度无关,所以km值是酶的一个特征性常

17、数,如何测定米氏常数？,（1）v对S作图,双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）,米氏方程的转换,pH对酶作用的影响,pH影响反应速度的原因,(1)pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的 解离状态。,(2)过高、过低的pH导致酶蛋白变性。,因为它除了受到底物的种类、温度、时间等的影响外、还受底物浓度、酶浓度等因素的影响。,例:碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时,s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0,酶的最适pH不是一个固定的常数,温度对酶反应速度的影响,它随底物的种类、浓度,溶液的离子强度,pH,反应时间等的影响。,最适温度与最适

18、pH一样，也不是一个固定的常数,激活剂（activator）对酶反应速度的影响,酶的激活剂：能提高酶活力的物质,1.无机离子,金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。,阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等,2.有机小分子:如Cys、GSH等,3.具有蛋白质性质的大分子，如一些蛋白激活。,抑制剂(inhibitor)的影响,抑制作用（inhibition）：使酶的必需基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失去活性的物质,1、不可逆抑制作用(irreversible inhibition),2、可逆抑制作用(reversible inhibition

19、),（2）非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition),（1）竞争性抑制作用(competitive inhibition),1、不可逆抑制作用（irreversible inhibition）,E+I EI,例:DFP（DIFP）对胰凝乳蛋白酶的抑制,抑制剂与酶分子上的某些基团共价结合,2、可逆抑制作用(reversible inhibition),（1）竞争性抑制作用（competitive inhibition）,E+I EI,例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用,抑制剂的结构与某种底物的结构类似,竞争性抑制作用动力学方程,EI+S no reaction,推导出

20、的方程,竞争性抑制作用动力学方程的特征,当 I 0时，方程还原成米氏方程。,当 I 时，,1/2Vmax,竞争性抑制的应用,对-氨基苯甲酸,对-氨基苯磺酰胺,（2）非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition）,E+S ES ESI,E+I EI ESI,非竞争性抑制作用动力学方程,非竞争性抑制作用动力学方程特征,当I0,I,酶的别构效应,别构酶(allosteric enzyme)的特点：,有多亚基有两个中心：活性中心和别构中心,具有别构效应(allosteric effect),别构调节物(allosteric effector),能与别构酶结合并能调节其活性的物质

21、,别构调节物的类型,底物或底物类似物,小分子的代谢产物,别构激活剂（正效应物）,别构抑制剂（负效应物）,协同效应(cooperative effect),正协同效应,负协同效应,一个效应物分子与别构酶的别构中心结合后，对第二个效应物分子的结合所产生的影响。,别构酶举例,大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶（E.coli aspartate transcarbamylase,ATCase）,ATCase催化的化学反应,ATCase活性调节的机理,有催化活性的构象,无催化活性的构象,别构酶的形曲线,1/2Vmax-,酶活力的测定,注意事项：1、测定反应的初速度2、在一套固定条件下进行,测定方法,酶活力（en

22、zyme activity）,在一定条件下，分钟能转化mol底物的酶量称为一个酶单位(U)。,酶的比活力（specific activity，也称比活性）,指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示，可以用比活力来表示酶的纯度。,比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）,比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。,酶的制备,提取,纯化,保存,思考题：从肝细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300ml含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化步骤以后得到的4ml酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位，整个纯化过程的收率是多少？纯化了

23、多少倍？,酶的应用（临床方面）,消化类：胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶酶等,抗炎净创类：胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等,血凝和解凝类：凝血酶促使血液凝固，防止微血管出血。,纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，治疗血栓静脉 炎、冠状动脉栓塞等,解毒类：如青霉素酶能够分解青霉素分子中的一内酰胺环，使变 成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应。,Allosteric inhibitorsbind specificallyto the T state andmake it harder forsubstrate to switchenzyme into theR s

24、tate.,Allosteric activatorsbind specifically to theR state and pull moreof the enzyme into themore active R state.,ALLOSTERIC EFFECTORS bind specifically to either the T or the R states.Heterotropic(nonsubstrate)activators bind to and stabilize the R state,while heterotropic inhibitors bind preferen

25、tially to the T state.,TT,RT,RR,+S,+S,TT,RR,RT,+S,+S,序变模型(simple sequential model),齐变模型(concerted model),Simple sequential model for a tetrameric allosteric enzyme.The binding of a ligand(L)to a subunit changes the conformation of that particular subunit from the T(square)to the R(circle)form.This t

26、ransition affects the affinity of the other subunits for the ligand.,2、可逆的共价修饰调节,可逆的共价修饰(covalent modification)方式：,可逆磷酸化(phosphorylation)可逆腺苷酰化(adenylylation)尿苷酰化(uridylylation)甲基化(methylation),COVALENT MODIFICATION IS A MEANS OF REGULATING ENZYME ACTIVITY,Phosphorylation Is a Highly Effective Means

27、 of Regulating the Activities of Target Proteins,糖原磷酸化酶,磷酸化酶b(活性低),磷酸化酶a(活性高),酶活力和比活力的表示方式,（1）酶活力（enzyme activity）,酶活力的定义：在一定条件下，分钟能转化mol底物的酶量,酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit,U）,酶单位的定义,1961年国际酶单位（IU）,1972年Katal（简称Kat）单位,（2）酶的比活力（specific activity，也称比活性）,比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。,比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）,比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。,酶的分离纯化和活力测定,纯化的一般原则,