生化反应工程酶促反应动力学.ppt
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1、,第二章 酶促反应动力学,酶促反应动力学在生物反应工程中的地位,生物反应动力学生物反应器生物反应过程的放大与缩小,酶促反应动力学微生物反应动力学废水生物处理反应动力学,生物反应工程的研究内容包括哪些?,2.1 酶促反应动力学的生物学基础,酶的基本概念,什么是酶?酶是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂。,“经典”酶学理论:酶蛋白质。,部分RNA也具有生物催化能力,通常称之为“核酶”。,1982年,美国T.Cech等人发现四膜虫的RNA有催化活性,具有自身切接能力。,核酶的数量少,多作用于核酸。,2.1.1.1 酶的分类,根据国际酶学委员会的规定,按照酶进行催化反应的类型,可将酶分为6类:,
2、1.氧化还原酶(oxidoreductases):羰基还原酶;2.转移酶(transferases):氨基转移酶;3.水解酶(hydrolases):腈水解酶;4.裂合酶(lyases):丙酮酸脱羧酶;5.异构酶(isomerases):葡萄糖异构酶;6.转接(或合成)酶(ligases):T4 DNA转接酶。,蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶?,2.1.1.2 酶的功能,酶的催化共性:a、降低反应的活化能;b、酶可改变反应速率;c、不改变反应的平衡常数。,2.1.1.2 酶的功能,酶的生物催化特性:a、有很强的专一性:底物专一性、反应专一性、立体专一性等;b、有较高的催化效率:比非催化反应高108-1
3、020倍;c、酶的调节功能:抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等,酶的催化效率可用酶活表示。酶活的定义:国际酶学委员会规定,在一定条件下,1 min能催化1 umol底物转化为产物所需要的酶量为一个国际酶活单位(IU)。,2.1.1.3 酶的稳定性,引起酶失活的原因:a、酶活性中心特定氨基酸(或其它)残基 被化学修饰;b、外部环境的影响;c、酶的高级结构变化;d、多肽链的断裂。,2.1.1.3 酶的稳定性,保持酶稳定的方法,2.2 均相酶促反应动力学,什么是均相反应?指酶与反应物系处于同一相(液相)的酶催化反应。,葡萄糖脱氢酶,葡萄糖,葡萄糖酸,水相,酶促反应动力学基础,
4、锁钥模型(Lock and Key Model),酶与底物的作用机理,解释了酶的专一性;局限性:无法解释可逆反应。,酶与底物的作用机理,诱导契合模型(Induced-Fit Model),像手与手套的关系。当底物接近酶的活性中心并与之结合时,酶的构象能发生改变,更适合于底物的结合。,影响酶促反应的因素,浓度因素(酶浓度,底物浓度,产物浓度等)外部因素(温度,pH,压力,溶液的介电常数,离子强度等)内部因素(酶的结构等),反应速率及其测定,若用单位时间内生成物浓度的增加来表示,则:,反应速率:单位时间内反应物或生成物浓度的改变。,设瞬时dt内反应物浓度的很小的改变为dS,则:,酶促反应动力学分类
5、-反应级数,零级反应 反应速率与底物的浓度无关,称为零级反应。,(S-底物浓度,rmax-最大反应速率),酶促反应动力学分类-反应级数,一级反应 反应速率与底物浓度的一次方成正比,称为一级反应。即酶催化AB的过程。,(S-底物浓度,k1-一级反应速率常数),酶促反应动力学分类-反应级数,二级反应 反应速率与两个反应物的浓度成正比,称为二级反应。,该反应可以是两个相同的反应物反应生成产物(2S P);也可以是两个不同的反应物反应生成产物(AB P)。,(S-底物浓度;A、B-底物A、B的浓度;k2-二级反应速率常数),单底物酶促反应动力学,最简单的酶促反应:单底物不可逆酶促反应。,k1,k-1,
6、E,S,ES,E,k2,P,反应机制:,反应动力学方程如何求取?,1.Michaelis-Menten快速平衡学说2.Briggs-Haldane稳态学说,反应动力学方程的推导,快速平衡法的几点假设条件:底物浓度S远大于酶的浓度E,因此ES的形成不会降低底物浓度S,底物浓度以初始浓度计算。不考虑P+EES这个可逆反应的存在。ES在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。,快速平衡学说,E,S,ES,E,快速平衡学说,由假设2可得到产物的合成速率为:,(2),(1),P,由假设3可得到:,反应体系中酶量守恒:,(3),由前面的公式(2)得:,代入公式(3),变换后得:,(4),(5),代入公式(1)
7、,变换后得:,式中:,rp,max=k2E0:最大反应速率 如果酶的量发生改变,最大反应速率相应改变。KS=k-1/k1:解离常数,饱和常数 低KS值意味着酶与底物结合力越强。,(6),稳态学说,稳态学说的几点假设条件:底物浓度S远大于酶的浓度E,因此ES的形成不会降低底物浓度S,底物浓度以初始浓度计算。在反应的初始阶段,产物浓度很低,P+EES这个可逆反应的速率极小,可以忽略不计。ES的生成速率与其解离速率相等,其浓度不随时间而变化。,Experimental data demonstrated the concentration profiles.,当反应系统中 ES的生成速率与分解速率相
8、等时,ES浓度保持不变的状态称为稳态。,由于SE0,所以SES,S-ESS,根据稳态假说,,(7),(3),(8),(Km米氏常数),(9),(10),式中:,对米氏方程的讨论:当SKm时,属零级反应。当SKm时,。,米氏常数Km的意义,Km值代表反应速率达到rpmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数,Km的大小只与酶的性质有关,而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH和离子强度等因素会影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。,动力学参数的求解,对rmax和Km的确定的方法有:Lineweaver-Burk法;Hanes-Woolf法;Eadie-Hofstee法;积分法 等。,Lin
9、ewever-Burk双倒数法,将米氏方程式两侧取双倒数,得到下列方程式:以作图,得到一直线缺点:实验点过分集中在直线的左下方,影响Km和Vmax的准确测定。,例:在pH5.1、15下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度V0如表所示。求这一酶促反应的动力学参数rmax和Km。表1-1 葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度与底物浓度,解:采用Lineweaver-Burk法,对实验数据回归,有则,2.2.2.2 操作参数对酶促反应的影响,pH改变可破坏酶的空间构象,引起酶活的丧失。pH的改变影响酶活性中心催化基团的解离,从而使得底物转变成产物的过程受到影响。pH的改变影响活性中心结合基团的
10、解离状态,使得底物不能与其结合或者结合后不能生成产物。,pH对酶反应速度的影响,2.2.2.2 操作参数对酶促反应的影响,温度对酶反应速度的影响,A、在一定范围内,当温度升高时,与一般的化学反应一样,反应速度加快。B、当温度过高,会导致酶的变性,从而失去活性。,抑制剂对酶促反应速率的影响,失活与抑制【失活】(inactivation):由于酶蛋白分子变性而引起的酶活力丧失的现象称为失活。【抑制】(inhibition):由于酶的必需基团化学性质的改变,但酶未变性,而引起酶活力的降低或丧失,称为抑制作用。,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,可逆抑制,【可逆抑制】(reversible inhi
11、bition):抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失,能用物理方法除去抑制剂而使酶复性,这种抑制作用是可逆的,称为可逆抑制。【不可逆抑制】:如果抑制剂与酶的基团成共价结合,则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如:重金属离子对酶的抑制作用。,不可逆抑制,抑制,可逆抑制和不可逆抑制,竞争性抑制(competitive inhibitions),当反应物系中存在与底物的结构相似的物质,这一物质也可能与酶的活性部位结合,形成非活性的复合物,阻碍了酶与底物的结合,从而影响酶促反应,这种抑制作用称为竞争性抑制。,1、抑制剂是底物的类似物;2、提高底物浓度可消除竞争性抑制
12、。,竞争性抑制(competitive inhibitions),非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions),当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合,且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑制。,与竞争性抑制相比较,当有非竞争性抑制剂时,无论如何提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。,非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions),反竞争性抑制(Uncompetitive Inhibitions),这种抑制剂仅能与ES复合物结合,而与游离酶不能直接结合。,各种抑制的比较,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,底物抑制(Su
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