GB T 21870-2008 天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定改进Lowry法 标准.docx

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1、ICS 83.040.10G 45OB中华人民共和国国家标准GB/T218702008/ISO12243:2003天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定改进LOWry法Medicalglovesmadefromnaturalrubberlatex一Determinationofwater-extractableproteinusingthemodifiedLowrymethod(ISO12243:2003,IDT)2008-0574 发布2008-10-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会biaoh-XX.刖三本标准等同采用IS012243:2003天然胶乳医用手

2、套水抽提蛋白质的测定改进LoWry法(英文版)。本标准等同翻译ISO12243:200310ugmL5gmLW2.5gmL,同时用抽提液(6.2)作空白。溶液可稳定冷藏2d(见注)。注：将适当浓度的溶液进行双倍逐级稀释可得到更低浓度的溶液，这些标准溶液应有较宽的浓度范围，具体浓度值可通过已知浓度的贮备液(见6.4)得到。这些溶液还要求符合附录A中的验证步骤。7.4 蛋白质的沉淀与浓缩7.4.1 总则在(255)条件下逐一进行测试。7.4.2 分别准确移取4mL抽提液(6.2)(作为一个空白样)、蛋白质标准溶液(见7.3)和3个手套抽提液置于IomL的离心管3)中，各加入0.4mL的DOC(6.

3、3.6),混匀并静置10Inin,然后各加入0.4mL的TCA(6.3.7)并混匀，再各加入0.4mL的PTA(6.3.8),混匀并再静置30min(见注)。注；溶液最须满足比色分析的需要，如使用酶标仪测定，则可以适当地减少用量。如样本量大，则特别注意清楚标识每个离心管。GB/T2187020081SO12243:20037.4.3 将离心管在不低于60000ms2（6000g）的条件下离心30min,确保蛋白质充分沉淀，如有必要可延长离心时间。倾去上层清液，将每个离心管倒置在滤纸上，让水流干。在每个离心管中各加入0.8mL浓度为0.2molL的NaOH溶液（6.3.5）（包括空白样），用来再

4、溶解蛋白质沉淀，必要时使用漩涡混合器或超声波仪（5.7）,使蛋白质沉淀溶解完全。确保蛋白质完全再溶解至澄清溶液，假如还有蛋白质沉淀，可继续加入定量的不超过3.2mL的NaOH溶液（即总量为4.OmL）,在每一个溶液中加入NaOH溶液的量应相同。加入推荐量0.8mL的NaOH溶液时，浓缩因子F为5,如果每个样加入NaOH溶液的量不相同，那么F也不相同：F=沉淀前抽提液体积一溶解一百通所用NaoH溶体积溶解后的蛋白质溶液最好是当天测定，如测定不能立即进行，则溶液可在不超过79的条件下贮存且不超过24h。如果加入4.OmL的NaOH溶液后沉淀还没完全溶解时，可在60000ms2（6000g）的条件下

5、离心15min直至出现澄清蛋白质溶液为止。7.5比色检验7.5.1按使用说明打开分光光度计并调零。7.5.2分别在0.8mL再溶解蛋白质溶液及空白样（7.4.2）中加入0.3mL的试剂A（6.3.1）并混匀；加入0.1mL的试剂B（6.3.2）,混匀，在测定吸光度前至少静置15min但不得超过1h。注：只需0.8mL再溶解蛋白质溶液用于显色反应，不考虑再溶解蛋白质溶液的总体积。如因某些干扰物质的存在导致静置过程中产生沉淀，则应在比色检验前离心至澄清溶液。7. 5.3分光光度计测定加入试剂B后Ih内，移取7.5.2准备好的溶液到比色皿中，在750nm波长处（最好）或在规定波长600nm750nm

6、范围内对照空白样测定其吸光度。为统一结果，时间范围，仪器和选择波长必须保持一致，测定蛋白质含量时单位为Ug/g（见8.3）。8. 5.4酶标仪测定加入试剂B后Ih内，移取0.49mL7.5.2制备的溶液到平底酶标板中（见5.10.2）,在规定波长600nm-750nm范围内对照空白样测定其吸光度，测定蛋白质含量时单位为Pgg（见8.3）。8结果计算8.1 校准曲线以蛋白质校准溶液（见7.3）的浓度对应经过沉淀和再溶解（见7.5.3或7.5.4）后吸光度绘制一条校准曲线。注：在浓缩过程中会损耗一些蛋白质。本方法假设在浓缩过程中试样与标准溶液的蛋白质损耗率是一致。9. 2浓度计算3个抽提样中的每个

7、样品浓度C值根据其吸光度直接在校准曲线上读取，单位为ugmL,结果取中值。注：在校准曲线不是线性的情况下，其值可通过多项式问归法来计算，采用商用计算机软件描绘曲线并计算未知浓度更实用些。8.3可抽提蛋白质含量的计算8. 3.1方法A剪切手套抽提方法用下式计算可抽提蛋白质的含量E,单位为ug/g。P5EH而GBT218702008ISO12243:2003式中：8.1.1 抽提液体积，单位为毫升(mL);c再溶解蛋白质溶液中蛋白质的浓度，单位为微克每毫升(UgmL);F浓缩因子；m整只被抽提手套的质量，单位为克(g)。注：除非使用NaoH溶液的量不是所推荐的景(见7.4.3),否则式中5/F为1

8、.每只手套中可抽提蛋白质的量可用下式计算，单位为Ugo每只手套中可抽提蛋白质的量=EXm8.1.2 方法B手套套手套抽提方法用下式计算每克手套中可抽提蛋白质的含量E,单位为gg式中：V抽提液体积，单位为亳升(mL);c一再溶解蛋白质溶液中蛋白质浓度，单位为微克每毫升(UgmL);F浓缩因子；m,被抽提手套样品质量(见7.2.3.6),单位为克(g)。注：除非使用NgH溶液的量不是所推荐的量(见7.4.3),否则式中5/F为1.每只手套中可抽提蛋白质含量可用下式计算，单位为go每只手套中可抽提蛋白质的量=Exm式中:m整个手套的质量=(11H+m2)/2,单位为克(g);m;和m2一双手套相应的

9、初始质量。8.1.3 单位表面积质量换算当结果需要用表面积来表示，例如：pg单位面积。可用下式进行换算，单位为Ug/dN:可抽提最白质的含量3gd11)=飞式中：A被抽提手套总表面积(见7.2.2.3),单位为平方分米(dm?)。9精密度9. 1背景2002年按ISO9272(当时在制定中)中所描述的精密度测定程序和指南进行了一次实验室间比对试验(ITP)来评估本方法的精密度。其他细节和术语可以查阅当时的ISOZTR9272,剪切手套和手套套手套两种抽提方法均通过以下试验进行了评估。为提高测量水平，采用4种原材料在7个实验室进行ITP试验，评估了1型精密度。每两组平行试验中，每组做3个重复试验

10、取平均值作为试验结果，精密度是依据测试结果来给定的，即；两组试验结果中某组的平均值。除有本精密度评估结果确实适用于产品或原材料测试的文件规定外，ITP试验的精密度结果不应作为任何原材料或产品接收或拒绝检验的依据。9.1 精密度结果4个样本的2个抽提过程的每一个精密度结果见表1。这些结果是依据ISo9272中的离群校正和离散删除方法来获得的。下面列举了精密度结果用法的概述，I和R为绝对精密度，(r)和(R)为相对精密度，见下面的附加说明。GBT218702008/ISO12243:2003表1精密度数据剪切手套抽提方法（方法A）原材料平均值/(ugg)实验室内实验室间实验室数量5,r(r)5gR

11、(R)114.33.489.768.37.5721.2148.55268.36.4618.126.512.635.251.553162.26.7919.011.725.170.343.354200.613.639.718.928.278.939.35手套套手套抽提方法（方法B）原材料平均值/(gg)实验室内实验室间实验室数量S.r(r)5RR(R)113.81.664.6433.64.7013.295.26253.14.9713.9326.316.345.686.063140.05.2514.7010.521.760.943.564164.211.2131.4019.132.691.455.6

12、6注：S,一一实验室内标准偏倚（以测量单位计）；r-重复性，即：实验室内精密度（以测量单位计）；（r）重复率（对平均值的百分比）；Sg一一实验室间标准偏倚（各实验室间的差异，以测量单位计）；R一再现性，即：实验室间精密度（以测量单位计）；（R）再现率（对平均值的百分比）；实验室的数量是去除离散数据的实验室后的数量。重复:性和再现性表述如下。重更性：每一种测试方法的重夏性或实验室内精密度根据表1中的值已经建立，每一种测试水平（原材料）的重复性或实验室内精密度值也列于表中。两个独立试验结果平均值的差（正确运用本标准获得的值）如大于表中对应的r和（r）值，r用测量单位计，（r）用百分数计，则应认为结

13、果不可靠，即：由不同样本数所致；建议进行相应的分析。再现性：每一种测试方法的再现性或实验室间精密度根据表1中的值已经建立，每一种测试水平（原材料）的再现性或实验室间精密度值也列于表中。不同实验室间的两个独立试验结果平均值的差（以本标准的专用方法获得）如大于表中对应的R和（R）值，R用测量单位计，（R）用百分数计，贝U应认为结果不可靠，即：由不同样本数所致；建议进行相应的分析。9.2 附加说明对剪切手套抽提方法而言，分析表明有两个实验室有明显的离群性，虽然根据ISO9272步骤进行离群校正，但重复性和再现性仍相当差，表1中剪切手套抽提方法的结果是删除了两个离群实验室后的数据，也就是5个参与实验室

14、的数据。就手套套手套抽提方法而言，同样也有一个实验室数据离群，得到的精密度差。表1中手套套手套抽提方法的结果是去除一个离群实验室的数据，也就是6个参与实验室的数据。9.3 偏倚偏倚是指测试结果的平均值与待测物的基准值或真实值之差，由于这些方法不存在基准值，因此，偏倚是不能估算的。10试验报告试验报告至少包含下列内容：a）采用的标准；b）充分区分测试样品的详细信息；c）试验结果和试验日期；d）所用标准蛋白质的来源和类别；e）所用缓冲溶液的种类；f）抽提方法（方法A或方法B）;g）如不是手套制造商的实验室，则注明实验室名称和地址;h）注明测定中观察到的任何异常现象。(JBT218702(M)8IS

15、()12243:2003附录A(规范性附录)验证A.1概述在手套生产中往天然胶乳中加入的表面活性剂、促进剂和抗氧剂等化合物，在测试过程中会对比色检验产生干扰，有些可能会减弱显色，而另一些可能会增强显色。沉淀和再溶解浓缩蛋白质的过程，目的是去除干扰以提纯蛋白质。在这个过程中损耗一定数量蛋白质是不可避免的；为满足检验目的，假定标准溶液的蛋白质损耗率与样品抽提液中的蛋白质损耗率相同。为了保证操作过程中蛋向质损耗最小，要求按以下步骤通过在沉淀与再溶解蛋白质标准溶液过程中，对实际回收量进行测试，验证初次实验室和(或)新实验员的技术能力。A.2原理通过对蛋白质标准溶液一式两份浓缩，每份溶液分两份进行比色测

16、试，以此来评价操作者工作的一致程度。A.3步骤A.3.1未沉淀蛋白质标准溶液的制备用0.2mol/L的NaoH溶液(6.3.5)将卵清蛋白贮备液(6.4)稀释制备成80ug/mL、40gmL.20g/mL10gmL5Ug/mL的蛋白质标准溶液。A.3.2沉淀用蛋白质标准溶液的制备同样地用抽提液(6.2)将卵清蛋白贮备液(6.4)稀释，制备成下列浓度的蛋白质标准溶液：40Rg/mL、20ug/nL、10ugU5gL1125g11LoA.3.3蛋白质沉淀与浓缩平行样按7.4步骤，将稀释后蛋白质标准溶液(A.3.2)沉淀处理，然后用0.2InoI/L的NaoH溶液(6.3.5)再溶解蛋白质沉淀，使每

17、份溶液的浓缩因子F都为5。A.3.4比色检验与测定按7.5步骤，测定非沉淀蛋白质系列溶液的平行样(A.3.1)和沉淀再溶解后的蛋白质系列溶液(A.3.3)的平行样。A.3.5计算以未沉淀蛋白质标准溶液的平均吸光度相对应的浓度（见A.3.1）绘制一条校准曲线，利用校准曲线测定沉淀浓缩后蛋白质溶液的浓度（见A.3.3）,浓度C取4个测试值的平均值（每份标准蛋白质溶液分两份沉淀，比色检测前又分两份，共4个检测值）。A.3.6回收百分率回收百分率是蛋白质标准溶液（见A.3.2）沉淀前的浓度cF,对应其起始浓度所得到的百分数。例如：起始浓度为50ugmL的蛋白质溶液，经沉淀与再溶解至5倍浓度（F=5）后

18、，浓度C为200ugmL,那么c/FMOg/mL并不等于50gml,这反映了在过程中有损耗。用真实值的百分数即（40/50）XIOo=80%来表示，得出回收百分率。A.3.7要求浓度低于100UgmL时其回收百分率应不低于80缸如果达不到要求需重新试验，试验过程中应特别注意操作技能。在测试手套样品前应验证操作员的操作技能。附录B(规范性附录)聚丙烯和聚乙烯管对蛋白质的吸附量8.1 概述由于聚丙烯和聚乙烯管对蛋白质吸附量小，所以在整个过程中使用聚丙烯和聚乙烯管，本方法适用于实际吸附量的检测。试验应在一天内完成。8.2 步骤8.2.1 用抽提液(6.2)稀释卵清蛋白贮备溶液(6.4),制备50mL

19、浓度为IOHgmL的参比溶液。8.2.2 分别移取IOmLB.2.1制备的卵清蛋白溶液至两个聚丙烯或聚乙烯管3)中，用振动器(5.6)振动，确保整个试管表面被溶液湿润。30min后，将溶液转移至另两个管中并振动，重复此步骤直至每组的IOmL溶液分别将5个管全部浸润，保存剩下的试验溶液。8.2.3 按7.5中给定的方法3次测试B2,l制备的参比溶液和B.2.2制备的两个试验溶液的蛋白质浓度，每份溶液分3个平行样。8.3 计算用下式计算每个管吸附卵清蛋白的平均质量，单位为哨。期个管吸附卵清果白的平均质量=1噂二。=2(R-T)式中：R参比溶液中卵清蛋白含量的3次检测结果的平均值；T浸润试管后剩余测

20、试溶液中卵清蛋白含量的平均值(即6个值的平均值)。8.4 要求测得卵清蛋白的吸附量应低于10Ug/管，如超过此值，则试管不适用于测试。GBT218702008ISO12243:2003附录C（资料性附录）可选用的分析方法C.1使用改进LoWry方法测定水抽提蛋白质存在自身的难度，此论断得到了认可。表面活性物质和某些促进剂可能对测试有干扰，导致结果假性偏高或偏低。为减少这种干扰，本标准中规定了关于抽提蛋白质的沉淀和再溶解的详细方法，尽管结果不能完全满意，特别是对于某些促进剂更是如此。虽然技术验证这个分析过程有利于弥补这个问题，但在蛋白质沉淀和回收过程中可能还是有潜在损耗。用背景扣除法可降低干扰（

21、见附录D）。还有其他分离或测定蛋白质的方法，当对本标准测得的数据有疑问时，这些方法可用于复核。下面简单描述的两种方法，虽然目前还存在一些缺陷，但将来可能会成为很好的分析方法。C. 2酶联免疫吸附分析法ELISA（enzyme-1inkedimmuno-sorbentassay）本方法是依据蛋白质与蛋白质抗体发生过敏反应来测试的。这种方法存在的问题是用时较长且过于专业化。做这个测试最理想的方式是某一特定分子量范围内的蛋白质与单一抗体（如多肽）发生反应。然而，尽管导致过敏反应的几种蛋白质能够从天然浓缩胶乳中分离出来，但并不是所有易过敏者对同种类蛋白质发生过敏反应，也就是说，有些人过敏反应可能较轻微

22、，但有些人则可能较严重。用相反的方法，即：使用取自混合血清的非均质抗体混合物进行测试，结果也不令人满意。原因是不同分子量的蛋白质间的比率不是恒定的，这个比率可能随着抽提情况不同而变化，也可随着橡胶树品系的不同而不同。这意味着需要结合不同的抗体与不同的抗体和不同分子量的蛋白质之间的反应结果而定。C.3高效液相色谱法HPLC（high-performanceliquidchromatography）本方法是通过凝胶分离蛋白质或者通过蛋白质水解后测定氨基酸来完成，这两种方式速度缓慢且费用昂贵。这种方法可以把与各种分子量范围的蛋白质在一起的所有于扰物彼此分离出来，然而，有必要识别出每种被分离的蛋白质分

23、子量范围，以便将各正确组份集中。如果采用水解蛋白质来检测其氨基酸方法，则分不出检测到的氨基酸由哪种蛋白质所产生的。附录D(资料性附录)背景扣除法D.1概述这是一种可以对手套抽提液中存在的干扰予以较好校正的方法。本试验依据LOWry等口人最初观察，蛋白质和福林试剂的显色反应主要因为有铜的存在：而干扰物与福林试剂并不是因为铜才呈显色反应。本方法也可参照用于测定手套中干扰物质的含量。D.2原理将从手套中抽提出来再溶解沉淀的蛋白质分成平行两份，一份按7.5用于比色检验，另一份在显色反应时，试剂D(6.3.4)中不加硫酸铜，所得吸光度称为“背景”，然后在前一份含铜组分的最终测试结果中减去“背景”。D.3

24、试剂D.3.1试剂DA:碱性柠檬酸钠，当天制备,用10份试剂C与0.2份试剂DD混合。D.3.2试剂B:见6.3.2。D.3.3试剂C:见6.3.3。D.3.4试剂DD:将3g柠檬酸钠溶解在IoomL水中的溶液。D.4步骤D.4.1按本方法与7.5所述的测试方法进行平行试验。再溶解蛋白质溶液的用量应足够用于4个测量样(两组平行样)。根据仪器情况，可能有必要增加蛋白质抽提液的量，随着沉淀量的加大，再溶解蛋白质沉淀时NaOH溶液也要作相应的调整。D.4.2按7.5中的方法同时用7.3中制备的蛋白质标准溶液进行此步骤。D.4.3接着用试剂DA(D.3.1)代替试剂A(6.3.1),按7.5的步骤测量

25、背景值。Ih内在600nm750nm范围内同一波长测量吸光度，结果取每组平行样的平均值。D.5结果表示以7.3中制备的蛋白质标准溶液浓度对应它们已扣除背景的吸光度绘制校准曲线。D. 5.2计算用含有铜的试剂时测得的抽提蛋白质溶液的吸光度减去背景值，直接在标准曲线上读取浓度，单位为igmL用不含有铜的试剂（D.3.4）测得的蛋白质抽提液的吸光度（即背景）对应于标准曲线，读取浓度，可能获得一个等同于蛋白质的干扰物含量。GBT218702008ISO12243:2003参考文献1 MARKELL.生物化学.1978,87206.ISO9272橡胶与橡胶制品试验方法标准精密度的确定.3 ISO/TR9272:1986橡胶与橡胶制品测试方法标准精密度的确定.4 CHEN,S.F,etai,J.AllergyClinJmmunol,100,pp713-4(1997).5 1.xwryetaI,J.Biol.Chem,1951,199:,265.