现代细胞生物学研究方法学生.ppt

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1、现代细胞分子生物学研究方法吴 乔Add：生物馆II 322Tel：21879592010.9,基因研究的各种方法,Northern blotting关键点：DNA探针，标记试剂盒（同位素和非同位素）；设内标；优点：特异性和敏感性高缺点：实验繁琐，同位素,基因水平的检测,同位素标记细胞中的受体基因表达水平,RT-PCR,RT-PCR主要由两大步骤组成，一是反转录（RT），二是PCR。它与普通PCR的区别就在于它是以mRNA为最初始的模板。RT-PCR的用途很广泛，既可以用来构建cDNA文库，也可以获得感兴趣的基因的cDNA序列。如果以内源的一些参照为标准，还可以用于研究细胞内特定基因的mRNA的

2、表达水平。关键点：mRNA，相关引物，PCR仪不足：只能相对定量，不能 绝对定量,（reverse transcription-polymerase chain reaction),Real-time PCR,实时定量PCR技术是近年来发展起来的一种新的基因定量检测技术，它通过PCR扩增中Tag酶的53的核酸外切酶活性，可以将标记在探针上的荧光基团一淬灭基团分离，使荧光基团脱离淬灭基团的控制，从而产生荧光发射。通过荧光吸收装置检测发出荧光的多少来反映模板量的高低，从而达到实时定量的目的。关键点：引物设计，real-time PCR仪,倍数差,原位杂交定位基因的表达,1，组织/细胞固定-脱水-石

3、蜡包埋-切片2，DNA 探针的制备（地高辛或同位素标记）3，探针标记mRNA-显示mRNA4，显微镜观察关键点：相应的DNA 探针；地高辛试剂盒或同位素，切片机；对照组的设置,对照组,实验组,KAI1,RNA干扰技术,发现者获得诺贝尔奖；RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种可以在细胞内抑制特定基因表达的现象。它由双链RNA产生，可以特异性地降解具有相同或者相似序列的RNA（包括mRNA）。它是一种比反义技术更为有效的方法，具有更高的特异性。,关键点：确定1921寡核苷酸（一条基因上有许多条候选寡核苷酸），cDNA转录成mRNA的试剂盒（效果好但价格贵），或表达载体p-

4、Super,转染试剂盒；要设置好对照（不相关的序列）不足：干扰不够稳定、不完全，不能长时间作用,荧光酶基因（Luc）是从萤火虫cDNA文库中克隆的哺乳动物细胞和组织没有任何内源性荧光素酶活力，所以Luc可作为非常灵敏的遗传报告基因荧光酶报告基因具有检测速度快、灵敏度高、费用低、用途广、可定量等优点,基因转录活性的检测（荧光素酶检测方法）,基因转录活性的检测（荧光素酶检测方法）,关键点：Luciferase-报告基因，表达载体，-gal,转染效率，荧光检测仪,基因芯片分析,设置好对照组，取样（mRNA）由公司测定，提供基因检测结果（根据细胞功能分类）排除变化相同的基因确定变化差异的基因选择感兴趣

5、的基因进一步证实它们的变化该方法特别适合用于信号通路中新的下游靶基因的发现,蛋白研究的各种方法,Western blotting关键点：相应的抗体；ECL显示试剂；设内标；不同抗体差别很大：用量、效果、特异性 使用的电泳胶的浓度与蛋白的分子量密切相关（反比关系）优点：可用于定量分析,蛋白表达水平的检测,蛋白半衰期,CHX(cycloheximide)放线菌酮,有的蛋白在细胞内的半衰期很短CHX的作用是抑制新蛋白的合成,免疫组织化学方法显示蛋白,1，组织/细胞固定-脱水-石蜡包埋-切片2，免疫组化染色3，显微镜观察关键点：相应的抗体；切片机；对照组的设置,对照组,实验组,蛋白的相互作用和蛋白与D

6、NA的结合分析,免疫沉淀/免疫印迹(Co-IP)Immunoprecipitation/Western blot,用特异性抗体结合细胞裂解液中的某个目的蛋白质（即免疫沉淀），洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot 分析显示另一个目的蛋白质。这种方法可以分析溶液中、细胞内的相互作用蛋白，但只能是定性或半定量的实验。,BIAcore生物分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Analysis）,基于表面等离子体共振（SPR）来实时跟踪生物分子间的相互作用的技术。被广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分

7、子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。具有高天然性、高效率、高灵敏度、样品量少、应用广泛等优点，但仪器昂贵、不易操作、价格高。,凝胶阻抑实验（Gel retardation assay）,当DNA结合蛋白与相应的DNA片段或寡核苷酸结合而形成DNA-蛋白质复合物后，使DNA片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的DNA片段的泳动速率慢得多，在X光胶片上形成一较游离DNA片段滞后的带型。,实验过程：DNA片段(probe)进行末端标记（同位素、生物素或荧光）-probe与核蛋白孵育-电泳-干胶-曝光,染色质免疫共

8、沉淀（ChIP）,利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内蛋白与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量 筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找 反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研 究RNA在基因表达调控中的作用。,DNA affinity purification assay（DAPA）,合

9、成拟分析的DNA片段，在DNA片段的末端接上biotin作为探针与核蛋白孵育，再与能耦合生物素的琼脂糖珠子免疫沉淀，最后利用western blot的方式分析，从而获得与DNA探针相互作用的蛋白质信息。,蛋白标记和定位,荧光显微镜技术,不同荧光素的激发光波长范围是不同的，所以同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记。标记荧光素的样品在荧光显微镜下经过不同波长的激发光激发，可以发射出不同颜色的荧光。荧光显微镜中只有激发荧光可以成象，因为产生激发光的光全被样品与照相机之间的滤光片吸收。关键点：相应的抗体；荧光染料；荧光显微镜,激光共聚焦显微镜技术,采用激光做光源,激光束经照明针孔,由分光镜反射至物镜

10、并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描,然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管探测收集,并将信号输送到计算机,在显示屏上显示图像。优点：分辨率高，可以实时跟踪观察,光漂白后荧光恢复(FRAP),光漂白后荧光恢复:就是在光漂白后对样本确定区中的荧光恢复。FRAP是由没有漂白的荧光团从周围进入漂白区的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。,光漂白中的荧光损失(FLIP),光漂白中的荧光损失：是一个邻近重复漂白区的被定义区域内荧光的减少或消失。

11、与FRAP一样，FLIP被用来测量膜或活细胞内分子运动的力度。,细胞异体融合,通过诱导融合剂可以诱导细胞融合。目前比较有效的融合剂是高pH，高Ca，和聚乙二醇PEG。最常用的两种细胞融合：NIH3T3,HeLa研究过程需要用CHX，以抑制新的蛋白合成,小鼠成纤维细胞:NIH3T3人宫颈癌细胞:HeLa,相差显微镜技术,相差显微镜和普通光学显微镜最主要的不同点是在物镜后面安装一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起了放大的作用。最后，这两组光线经过透镜又会聚 成一束，发生互相叠加或抵

12、消的干 涉现象，从而表现出肉眼明显可见 的明暗区别。最大优点：样品无需染色，可以观 察活细胞,流式细胞技术的应用细胞分选周期、凋亡测定细胞表面蛋白定量DNA渗入量测定线粒体膜电位测定,流式细胞术定量分析细胞凋亡率和细胞周期,DAPI染色细胞流式细胞仪分析可用于分选细胞,流式细胞术直接定量分析细胞存活率,PI（碘化丙啶）染色细胞，不能透过活细胞膜，但可以结合到死细胞的DNA碎片上。所以细胞表现出不同的荧光值。,流式细胞术定量蛋白表达量,限制：仅用于膜蛋白含量的检测。关键点：抗体，相应的荧光素标记的二抗；流式细胞仪。蛋白表达量以面积表示。,流式细胞术检测细胞中DNA合成量(BrdU法),JC1是一

13、种碳氰化合物类阳离子荧光染料，具有电势依赖性积聚于线粒体内膜的特性。它在线粒体上以单体和聚合体两种不同的物理形式存在。JC1特异地与线粒体内膜结合，只在线粒体膜电位崩解的时候才释放出来，因此，检验结果可靠，敏感性高。,荧光探针JC-1检测线粒体膜电位,蛋白结构的分析,利用Edman降解法直接测定蛋白质分子中的肽段序列，并拼接出蛋白质分子的全序列。根据蛋白质的cDNA序列的测定，推断出蛋白质分子的序列。质谱分析：通过酶解产生肽段片段，通过质谱仪分析肽指纹图谱，从而获得氨基酸序列，再与网上蛋白库匹配，来确定是已知还是未知蛋白。,蛋白质一级结构测定方法,生物质谱检测制备技术,2D胶电泳切胶脱色脱水还

14、原烷基化洗胶脱水泡涨脱水重泡涨酶切萃取干燥质谱分析,主要国际互联网上的免费蛋白数据库检索程序，网址如下:Mascot http:/MS-Fit:htmlucsf3.0/msfit.htm Peptident:peptidennt.html PeptideSearch:Services/PeptideSearch,数据库检索网址,蛋白质空间结构测定方法,X射线衍射方法测定蛋白质分子的晶体结构。二维核磁共振技术测定蛋白质分子在溶液中的结构。用于测定蛋白质空间结构相对变化和变化速度的方法有：荧光滴定技术，紫外差吸收，园二色光谱，红外光谱，Raman光谱，脲梯度电泳，各种反应基团的暴露。,核磁共振仪分

15、析蛋白质的二级结构,核磁共振图谱,计算方程：lg(Fo/F-1)=lgKA+nlgQ；其中：Fo，F分别为蛋白质与药物作用前后的荧光强度；Q为药物浓度；KA为结合常数。以lg(Fo/F-1)对lgQ作图，可求得药物与蛋白分子的结合常数和结合位点数。,荧光滴定方法分析小分子化合物与蛋白的结合,关键点：荧光分光光度计纯化蛋白（能够自发荧光，脯氨酸、色氨酸基团）,蛋白质相互作用仪,Cell,virus,bacteria,protein,DNA and small molecular;antibody-antigen,receptor-ligand,DNA-DNA,DNA-protein,protei

16、n-small molecular etc.,全自动，高通量，实时检测，快速分析生物分子之间的相互作用;相互作用分析包括：分子结合定量分析,动力学和亲和性分析，结合能力和协同性分析（结合速率Ka，解离速率Kd，结合常数KD）不用对样品作任何标记和修饰,圆二色谱分析蛋白构象改变,旋光值计算：,分子对接模拟预测化合物与蛋白结合的模型,Kd=1.68 M,Kd:ND,分析超离方法检测化合物与蛋白的相互作用,原子力显微镜(AFM),优点：1)原子力显微镜作为扫描探针显微镜的一种，可观察生物形态结构。2）利用AFM,可使得细胞及生物大分子在生理溶液的条件下成像。AFM对于生物系统的成像分析比光学显微镜具

17、有更高的分辨率（大约可以到1nm），比电镜观察所需要的样品处理更接近于生理条件，并且比光谱学技术（通常需要从大量光谱信号中间接推导出结构信息）更直观。而相对于晶体学方法来说，AFM分析不需要依靠于晶体样品，这非常有利于研究天然状态下的生物样品。,透射电子显微 镜,TEM优点：1，极高的分辨率和放大倍数;2，样品室往多功能发展;3，自动化程度高;4，与其它附件，如能谱、扫描等相连接，拓展了仪器的分析功能.不足：1，样品制备技术繁琐;2，对单个原子显微观察不理想;3，图像为二维平面像;4，样品是“死”的.,扫描电子显微镜,优点：1，样品制作较简便 2，样品可动自由度大 3，图像富有立体感 4，放大

18、范围广 5，可从观察样品表现形貌获得 多方面资料 6，可进行微区成分分析。不足：1，分辨率较低（3060埃）2，观察“死”样品 3，观察样品表面,蛋白修饰,泛素化(ubiquitination)类泛素化(sumoylation)甲基化(methylation)乙酰化(acetylation)磷酸化(phosphorylation),国家自然科学基金国家“973”重大研究计划,研究的必要性和重要性,蛋白质是基因功能的实施者，蛋白质的定位、翻译后修饰及蛋白质-蛋白质相互作用决定了蛋白质的功能，也为研究细胞生长，分化和凋亡及重大疾病发生和发展提供了基础。蛋白质的功能与其空间定位有着密切的相关，且通过

19、在不同亚细胞环境里的转位而发挥作用。蛋白质的翻译后修饰对蛋白质发挥正常功能具有重要作用，经过特殊修饰的蛋白质通常可定位在特定的位置，与特异的蛋白质相互作用，行使特殊的功能。蛋白质通过动态相互作用，形成大的复合体，在特定的时间和空间中完成特定的功能，这其中也发生特定的蛋白质修饰。因此，只有系统研究蛋白质的定位、翻译后修饰及蛋白质-蛋白质动态相互作用的规律，才能从真正意义上阐明一个蛋白质的功能，才有可能研究细胞中某一生理活动中相关功能蛋白质的作用及机制。,泛 素 化,蛋白降解的系统,溶酶体蛋白溶解系统 非溶酶体蛋白溶解系统,泛素蛋白酶系统 钙依赖性的 蛋白溶解系统,泛素、26s蛋白酶体、酶系统(E

20、1、E2、E3、E4、泛素C末端水解酶),普遍存在于原核生物和真核生物细胞中，是真核细胞内最重要的非溶酶体性的蛋白溶解系统,主要功能是降解机体正常情况下特别是应激状态下产生的异常细胞浆内短寿命蛋白质，包括一些重要的调节蛋白如转录因子、细胞周期调节因子和信号转录因子等。,（特异性低）,（特异性高）,泛 素,泛素是一种小蛋白，只有76个氨基酸（MW8.6KD）。目前发现所有生物的泛素都是由氨基酸编码的，而且序列相当保守。比较人与酵母的泛素序列，只有3个氨基酸不同。泛素的二级结构包括了5个-折叠，3-5个螺旋及7个反螺旋，其外观是一个紧密压缩的球状蛋白质，从球体的表面伸出4个C-末端残基，作为泛素化

21、蛋白质的结合位点.泛素肽链中约70%由氢键组成，决定了它的热稳定特性及耐受宽范围的pH值。泛素的功能位点是C-末端，用以结合蛋白质，而其Lys-48则作为其它泛素的结合位点，用以形成泛素链。,甘氨酸残基,C-末端残基,Positive charged,酶 系 统,泛素-激活酶（Ubiquitin-Activating Enzyme,E1）：在人类仅发现一种，主要功能是激活泛素;泛素-结合酶(Ubiquitin-Conjugating Enzyme,E2)：分子量较小，都有一个UBC结构域，可特异识别泛素，并与泛素结合，同时还具有识别E3的功能;泛素-蛋白连接酶(Ubiquitin-Protin

22、 Ligases,E3)：一类大分子蛋白质，结构复杂，主要作用是特异识别靶蛋白，并将其传递给蛋白酶体降解;泛素链组装因子(Ubiquitin Chian-Assembly Factor,E4)：结合泛素并催化E1、E2、和E3的组装,对多聚泛素链的延长起重要作用。,泛素C末端水解酶（UCHs）,UCHs多为含巯基蛋白酶，分子量大小不等，能特异识别泛素C末端区域，解离泛素与靶蛋白的结合,促进泛素再循环，所以对泛素系统的正常运行很必要。,蛋白酶体（26s）包括一个20s的中心颗粒和一个19s的调节颗粒，在20s颗粒中心由七个亚基的四个环组成一个中空室。亚基主要用于底物识别，亚基主要参与底物降解。,

23、蛋白酶体,泛素-蛋白酶体系统的作用途径,Western blotting显示泛素化带型,类 泛 素 化,Sumoylation,SUMO化蛋白,SUMO(small ubiquitin-related modifier)是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。SUMO化（sumoylation）的功能与泛素化(ubiquitination)不同，它并不使蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调节它们在细胞内的定位和分布.SUMO家族成员包括 SUMO-1，SUMO-2，SUMO-3。它们广泛存在于原生动物、后生动物、植物和真菌中，显示了SUM

24、O在进化上的保守性。,SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和碳端外延序列。在所有的 SUMO家族成员中，甘氨酸甘氨酸残基对 SUMO结合是必须的。,SUMO-1的三级结构包括一个与泛素同源区域（氨基酸序列2297）。这段序列紧紧的塞在泛素的一个superfold中，还有一个高度灵活的N端在类似泛素的中心突出。形成异肽键所需的甘氨酸残基在泛素和 SUMO-1中是保守的。在体内，甘氨酸残基很容易被C端水解酶分解。,甘氨酸残基,Positive charged,Negative charged,N-terminal,Positive charged,甘氨酸残基,C-末端残基,C-末端残基,当SU

25、MO被E1活化酶活化时，其碳端的苷氨酸残基发生ATP供能的腺甘酸化；随后，在SUMO的碳端和E1的丝氨酸残基形成一个硫脂的结合，并释放出AMP。在这一酯基反应中，SUMO被转移到E2连接酶UBC9上；UBC9与SUMO硫脂的结合促进SUMO的碳端和底物蛋白的Lys残基形成一个牢固的异肽结合。有的SUMO底物蛋白需要E3联接酶来促进它们的SUMO化,有的不需要E3。一般E3酶都不直接与SUMO结合，它只结合UBC9和底物蛋白，从而促进SUMO与底物蛋白结合，完成SUMO化。,SUMO的生物学功能,1,调节蛋白之间的相互作用2,调节蛋白在核浆间的转运3,调节蛋白的转录活性4,拮抗泛素化，使蛋白稳定

26、,I-B是SUMO的一个底物蛋白，它既能发生SUMO化，又能发生泛素化，而且由于SUMO化和泛素化的位点都是K21,SUMO会和泛素竞争结合位点。I-B是NF-B的抑制因子，NF-B在胞浆中由于和I-B结合呈现无活性的状态。I-B经肿瘤坏死因子TNF的刺激，在S32和S36发生磷酸化，进而被泛素化。I-B的降解使得NF-B的入核序列暴露，从而进入细胞核激活NF-B的靶基因。但是当I-B被SUMO修饰后却能免受TNF诱导的降解，使NF-BI-BSUMO复合体继续稳定的存在于胞浆中，进而抑制NF-B的转录活性。,I-B,NF-B,SUMO,Ubiquitination,TNF,NF-B,I-B,T

27、hree,磷 酸 化,在许多蛋白特别是转录因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。转录因子的磷酸化、去磷酸化可能影响：1）转录因子从细胞质向细胞核转运或相反。2）转录因子与特异DNA序列的结合。3）调节转录因子的转录激活功能区与其他因子的作用。机理：1，磷酸化增加了反式作用因子的反式激活结构域与基础转录元件或转录起始复合物之间的亲和力。2，磷酸化改变了转录活化结构域的空间构象。3，磷酸化促使反式激活结构域与阻遏蛋白解离，或促进其与DNA结合。4，增加蛋白质分子表面的负电荷。,蛋白质磷酸化的调控机理和特点,特点：1，迅速。2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆转。3，能够有效地整合来自不同转导途径的信号

28、。4，同一种激酶或磷酸酶都是多底物的，对不同转录因子的影响不同。5，蛋白因子上被修饰的氨基酸残基不同，对转录因子功能的影响也不同。,磷酸化研究方法,特异性磷酸化抗体直接证明CIAP或OA间接证明片段缺失突变和点突变直接证明同位素标记质谱分析,CIAP或OA处理细胞证明蛋白磷酸化,CIAP：牛小肠碱性磷酸酶，能够将DNA以及蛋白上的磷酸根基团去除（孵育蛋白）；OA：冈田酸，磷酸酶抑制剂（细胞处理）,片段缺失突变确定磷酸化的初步位点,点突变确定磷酸化的精确位点,(For Erk/MAPK),AKT:RXRXXS TR3:RDHLAS Motif,原理：将未被磷酸化的蛋白与被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水

29、解后，进行MS/MS分析，到数据库进行比对。由于磷酸化的片段上多了磷酸基团，因此其分子量将比为被磷酸化的片段要大，由此可分析出磷酸化的位置。,质谱分析蛋白磷酸化,乙 酰 化,乙酰化异常与疾病,CBP/p300的突变导致Rubinstein Taybi综合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。CBP/p300可抑制肿瘤的形成，在小鼠瘤细胞中发现CBP突变，在结肠和乳房瘤细胞系中发现p300突变。如果突变导致错误的激活去乙酰化酶或错误的和去乙酰化酶相互作用，将可能导致疾病的发生。甲基化CpG-结合蛋白-2(MeCP2)可募集去乙酰化酶到甲基化的DNA区域，使组蛋白去乙酰化导致染色质

30、浓缩。MeCP2突变导致Rett综合征，患者出生即发病、智力发育迟缓、伴孤独症。阻碍去乙酰化酶的功能，则可抑制癌细胞的增殖和分化，可用于急性早幼粒细胞性白血病,急性淋巴细胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治疗。,蛋白乙酰化的作用是维持染色质的开放结构，因而有利于转录因子与靶DNA结合，进而促使基因的转录。蛋白去乙酰化酶HDACs可移去H3 H4赖氨酸上的乙酰基，使带正电荷的赖氨酸残基暴露，从而增强与DNA的相互作用。而带正电荷的赖氨酸残基与DNA之间的相互作用可限制核小体在DNA之间的移动，使启动子接近转录调控元件，组蛋白低乙酰化使染色质失去转录活性。,蛋白乙酰化的作用,Motif:GK,SK,蛋

31、白转运和分布研究Protein translocationProtein shuttlingProtein traffic,蛋白质的转运过程,靶向(targeting)去折叠 分子识别 跨膜转运 分选和定位(sorting and localization)重折叠 组装（在去折叠和重折叠中还有分子伴侣(molecular chaperone)的参与),靶向运送的信息来自于：1,信号肽(也包括靶向线粒体的导肽 leader sequence)2,运送蛋白质分子本身的某些片段 如nuclare export sequence nuclear location sequence3,分泌蛋白自身的信息

32、,蛋白质细胞质 细胞核,蛋白质的合成是在核糖体上进行的，但是合成后的蛋白质必须定向的、准确无误地运送到特定的细胞器和细胞核中，才能保证细胞活动的正常进行。,蛋白入核转运,分子量小于45-50KD的蛋白：在不需要外界能量供应的前提下可以通过核孔自由进出（被动扩散）；分子量大于50KD的蛋白：依赖于能量和温度；需要胞浆运输因子；需要核孔复合体蛋白（主动运输）；,核定位序列（nuclear localization sequence,NLS）,单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸顺序排列而成（RKKKRKV）双分型NLS，由两簇碱性氨基酸被中间1012个非保守性氨基酸所分隔而形成（KRPAATKKA

33、GQAKKKKLDK）,protein,importin-,protein,importin-,importin-,protein,importin-,importin-,cytoplasm,NPC,importin-,protein,importin-,Nucleus,nucleoprotin,IBB,IBB,GTPase Ran/TC4,蛋白出核转运,核输出序列（nuclear exporting sequence,NES）F X表示任意氨基酸 I I X23表示23个任意氨基酸 L-X2-5-L-X2-3 L-L L 亮氨酸 V V 颉氨酸 M甲硫氨酸 M F 苯丙氨酸 I 异亮氨酸其特

34、征是富含亮氨酸（Leu），但与NLS无任何同源性;能够与NES结合的NES受体为CRM1，被称为exportin,在功能上与Improtin-相对应的核转运蛋白;为出核过程提供能量的仍然是NPC上的GTPase Ran/TC4;,为蛋白转运提供能量 Ran GTP,Ran是一种核蛋白，分子量为25KD，通过与不同的效应蛋白共同作用而相互调控。效应蛋白：Ran GTPase激活蛋白：RanGAP(细胞质)RanGAP结合蛋白：RanBP1 和RanBP2(细胞质-细胞核)鸟嘌呤核苷交换因子：RanGEF（也称RCC1）,细胞核中RanGTP再生,核转运因子-2(NTF-2)与RanGDP复合体到

35、达细胞核时遇到RanGEF（鸟嘌呤核苷交换因子），它便将Ran上的GDP替换成GTP。由于NTF-2与RanGTP无亲合力，这样RanGTP就可以释放在细胞核中。,蛋白核浆转运模型：含有典型的NLS序列的蛋白被importin-识别，再与importin-结合形成三聚体，并通过importin-靶向核孔完成蛋白转运过程。在细胞核中，RanGTP和importin-相互作用，使输入蛋白解体。此时importin-则自由地结合到其输出受体CAS上，CAS和RanGTP再相互作用形成三聚体复合物，被转运到胞浆，由此重新importin-cycle。另外，importin-/RanGTP复合物也存在于

36、核中，重新importin-cycle。在胞浆中，RanGTP在RanGAP/RanBP1的协助下转换为RanGDP，然后重新通过NTF2的介导进行新一轮的蛋白转运。,核转运因子-2(NTF-2)RanGEF（鸟嘌呤核苷交换因子），它将Ran上的GDP替换成GTP。NTF-2与RanGTP无亲合力，所以可以释放在细胞核中。CAS：输出受体,蛋白转运调控,NLS的磷酸化:casein kinase II对NLS磷酸化有利于蛋白的入核转运;而P34cdc2对NLS磷酸化则抑制蛋白的入核转运。抑制蛋白的调节:一些转录因子与抑制蛋白结合时，其NLS被遮蔽，因而不发生核转运而滞留在胞浆。例如：NF-KB

37、与其抑制蛋白I-KB NLS的C端也可能发生自身折叠而发生遮蔽效应。反之，在一些触发剂的作用下，许多转录因子与其他蛋白形成复合物后处于激活状态而被转运到核内。胞浆锚定机制：在爪蟾卵细胞xnf7蛋白中，有一胞浆滞留区（CRD），具有很强的锚定功能；只有当CRD序列上的P34cdc2位点脱磷酸化后引起CRD失活，其锚定功能丧失，xnf7蛋白才能够转运入核。,核孔复合体装置：生长抑制期的细胞核孔通道有效直径明显低于细胞增殖期的有效直径；在增殖细胞核中，核孔通透性或核孔数目也不同于生长抑制期的细胞。蛋白激酶磷酸化位点：如SRF蛋白是一种转录因子，其入核需要PKA活性，但不是直接被PKA磷酸化，说明蛋白激酶除了对转录因子直接磷酸化外，还可能对蛋白入核转运下游的其它蛋白磷酸化，从而间接影响转录因子的转运。,蛋白转运调控,开展科学研究的几点思考,搞科研一定有创新精神！（仔细观察）搞科研一定要有连续性和系统性！搞科研一定要多看、多问、多动手、多思考！（阅读文献，讨论，提问题）搞科研一定要耐得住寂寞！（不急于开题）搞科研一定要要踏踏实实！（实验基本功）搞科研一定要持之以恒！,方法,态度,科学研究的策略,发现新现象分析作用机理阐释生物学功能 在分子、细胞、动物、临床水平开展研究 生物学功能与生理现象结合 结构与功能结合 一个结论要用不同的实验来证实,