现代分离技术-亲和层析.ppt

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1、现代分离技术-亲和层析,概念,亲和层析是利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术。,分离原理,亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出

2、，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。,酶与底物(包括酶的竞争性抑制剂和辅助因子)，抗原与抗体，激素与受体，核酸中的互补链多糖与蛋白复合体。,对载体的要求,不溶于水，但高度亲水；惰性物质，非特异性吸附少；具有相当量的化学基团可供活化；理化性质稳定；机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；能抵抗微生物和醇的作用。,可以做为载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸

3、附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙烯酰胺凝胶是目前的首选优良载体。,琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和色谱的优良载体。琼脂糖凝胶结构开放，通过性好，酸碱处理时相当稳定，物理性能也好。琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐，并能在温和的条件下与氨基等基团作用而引入配体,对配体的要求,抗原或抗体必须单一特异性：抗原或抗体的纯化效果决定于固相中配体的纯度。抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间。配体必须有一个适当的化学基团，这个基团不参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接支持物，而且这种连接不应当影响

4、配体与大分子结合的亲和性。,适用范围,生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化,分类,生物亲和层析（BAFC）免疫亲和层析（IAFC）金属离子亲和层析（IMAC）拟生物亲和层析（Biomimetic AFC）,生物亲和层析,生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析通常具有很高的选择性典型的物质对有酶底物酶抑制剂激素受体等。,免疫亲和层析,免疫亲和层析以抗原抗体中的一方作为配基亲和吸附另一方的分离系统称为免疫亲和层析由于抗体与抗原作用具有高度的专一性并且它们的亲和力极强，所以许多典

5、型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体(简称单抗)作为亲和配基目前利用抗体抗原模式有可能得到每一种目标蛋白的单抗然后以单抗为配基通过亲和层析技术来分离纯化目标蛋白质。,金属离子亲和层析,金属离子亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基如组氨酸的咪唑基半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合这也是IMAC用于蛋白质分离纯化的唯一依据金属离子如锌和铜已发现能很好的与组氨酸的咪唑基及半光氨酸的巯基结合含有不同数量这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离,拟生物亲和层析,拟生物亲和层析是利用部分分

6、子相互作用模拟生物分子结构或某特定部位以人工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白质的亲和层析尤以氨基酸(包括多肽)亲和层析(AALA)和染料亲和层析(DAFC)为代表染料配基能通过共价键牢固的结合到亲和载体上由于价格低廉与蛋白质的结合容量高并且不易为物理或化学物质所降解因此也是一种较为理想的基团特异性配基。,第一步,载体和配体的结合 抗原或抗体结合到支持物上的方法目前有20多种，但可归结为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法4类。,第二步,与目标蛋白结合配体与目标蛋白发生特异性结合。,第三步,目标蛋白的洗脱 非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立

7、即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构 特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白,常用的解脱剂有0.2mol/LpH2.8甘氨酸HC1缓冲液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸钾（或钠）、1mol/L乙酸、6mol/L盐酸胍、0.2mol/LKC1等。作为抗原抗体解脱剂，最多用的是3mol/L硫氰酸钾（或钠）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液。,优缺点,亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。亲和层析具有高选择性高活性回

8、收率和高纯度等特点。,但是亲和层析技术也有一些缺点主要是载体(如琼脂糖Sepharose)价格昂贵机械强度低(易压床)配基的制备困难偶联条件激烈需要使用剧毒的活化剂(如CNBr)等。,七、亲和层析的应用,1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质 结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理,展望,与其它生化分离方法相比亲和层析技术具有高收率高纯度能保持生物大分子天然状态等优点广泛的应用于生物大分子的分离纯化特别是对含量极少的基因工程产品的一步纯化更显示出这一技术的优越性正是因为亲和层析技术的高度特异性才能制备出高纯度的生物大分子不仅

9、用于大规模生产而且用于动力学研究和结构测定。,新型载体的开发 利用多肽文库制备和筛选亲和多肽配基,新型载体的开发,商品化的亲和层析载体种类有限且价格昂贵远不能满足科研工作的需要在实际应用中往往需要对载体进行修饰改性或自制新的载体使其更有利于亲和吸附的进行以满足大规模工业生产的需要。据报道在我国壳聚糖(Chitosan)被广泛用于亲和层析载体其特点是没有非特异性吸附作用配基偶联方法简单此外Dommimic C.N.18 等以聚苯乙烯二乙烯基苯(PSDVB)珠为载体用聚乙二醇(PVB)修饰其表面制成了新的亲和层析载体这种载体具有良好的机械强度且PVA涂层消除了疏水相互作用避免了非特异性吸附的发生因此研制价格低廉机械强度高活化效率高的新型载体是亲和层析的一大热点。,多肽配基,应用组合化学的方法建立多肽文库，然后利用多肽文库来筛选与目的蛋白特异性结合的多肽配基这一观点的提出大大促进了亲和层析筛选及合成配基技术的发展。多肽文库的最新发展提供的一种合理高效快速的方法从成千上万的多肽中筛选出用于目的蛋白分离的配基。90年代初以来国外学者利用多肽文库筛选亲和配基的研究层出不穷并有许多成功的例子，然而在我国利用多肽文库筛选配基的技术仍未见报道不过从此方法的巨大优点来看它将是亲和层析研究的另一热点。,THANKS,