现代分子生物学复习.ppt

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1、2012分子生物学复习要点,分子生物学研究的基本定理：1.构成生物体有机大分子的单体在不同生物中都是相同的；2.生物体内一切有机大分子的构成都遵循共同的规则；3.某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。,在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易

2、于鉴定。,组蛋白的一般特性：进化上的保守性保守程度：H1 H2A、H2B H3、H4,1、组蛋白,上海生化所分子遗传学1998年试题：在真核生物核内。五种组蛋白（H1 H2A H2B H3 和H4）在进化过程中，H4极为保守，H2A最不保守（）,简述真核生物染色体上组蛋白的种类，组蛋白修饰的种类及其生物学意义中国科学院2003年硕士研究生入学生物化学与分子生物学试题,2)C值反常现象（C-value paradox)C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。,

3、C值矛盾,上海第二军医大硕士研究生入学考试试题：基因组的特点（真核、原核比较）,（五）原核生物和真核生物基因组结构特点比较,DNA双螺旋模型是哪年由谁提出的?简述其基本内容.为什么说该模型的提出是分子生物学发展史上的里程碑,具有划时代的贡献?浙江大学医学院2003生物化学（硕士）,1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。,（一）DNA的半保留复制（semi-conservative replication）,3、DNA半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代

4、的遗传信息稳定地传递给后代。,7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)：拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,1、双链的解开,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。ori(或o）、富含A、T的区段。,基本概念：,上海生化所1998年分子遗传学试题：真核生物复制起始点的特征包括（）A富含GC区 B富含AT区 C Z DNA D无明显特征,DNA的半不连续复制（semi

5、-discontinuous replication),DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。,在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。,3、DNA链的延伸,在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。,四、DNA的修复(DNA repairing),DNA修复是细胞对DNA受损伤后的一种反应，但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的

6、损伤而能继续生存。,DNA损伤来源,1、碱基的脱落（酸和热）2、碱基或核苷的改变（电离辐射和烷化剂等）3、错误碱基4、碱基的缺失或插入5、嘧啶碱基的二聚化6、链的断裂（化学试剂或电离辐射）7、DNA链的交联,大肠杆菌中DNA的修复系统,扼要说明细胞中DNA修复系统有哪几种（8分）中国科学院2002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题,5、SOS反应（SOS response）,SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。,SOS反应

7、广泛存在于原核和真核生物中，主要包括两个方面：DNA的修复，利于细胞的存活，具有重要意义；产生变异，可能产生不利的后果，如导致细胞的癌变。,DNA复制具有那些特点?复制是半保留的。原核生物一般只有一个复制原点，真核生物有多个复制原点。复制可单向进行，也可双向进行，后者更为常见。复制是半不连续的，两条链都是以5 3方向合成，其中，前导链是连续合成的，随从链(滞后链)是不连续合成的，即先合成短的冈崎片段，再连接成随从链。复制开始时需要一段引物RNA，在复制进行到一定程度后被切除，并以一段DNA代替。复制具有严格的保证复制准确性的机制。在复制过程中，有多种酶和蛋白质参与，可能就是保证复制准确性所必需

8、的，DNA聚合酶的校正作用，也可能是保证复制准确性的数种途径之一。,（二）转座子的类型和结构特征,1.原核生物转座子的类型：,1、插入序列(insertional sequence,IS)2、复合转座子(composite transposon)3、TnA家族,插入序列（insertional sequence,IS）P57,1.最简单的转座子,不含有任何宿主基因。2.是很小的DNA片段(约1kb)，末端具有倒置重复 序列。3.转座时常复制宿主靶位点415bp的DNA形成正 向重复区。4.大部分IS序列只有一个开放读码框。5.是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。,以基因的形式荷载遗传信息，

9、是生命遗传的物质基础。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存（DNA 复制）。作为基因复制和转录的模板，是个体生命活动的信息基础。DNA的生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生物个体性状（基因表达）。,DNA的基本功能：,基因表达(gene expression)：是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。,转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列为一个转录单元。DNA双链按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，

10、称为模板链(template strand)，也称作反意义链或Waston链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为有意义链或Crick链。,转录与复制的相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；都从5至3 方向延伸成新链多聚核苷酸；都遵从碱基配对规律 但转录忠实性要低于DNA复制。转录与复制都受到严格的调控,二、转录与复制的异同,转录和复制的区别,引物 有 无高度进行性 中途不停止 可一段一段复制,（一）原核生物RNA 聚合酶,RNA聚合酶（大肠杆菌为例）,全酶=核心酶+因子,第二节 DNA指导

11、下的RNA聚合酶,第 三 节 与转录起始和终止有关的DNA结构,一、原核生物的启动子和终止子,启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,（一）启动子结构,转录单元,1、Pribnow 框：,10区，保守序列为 TATAAT。Pribnow 框是RNA聚合酶的牢固结合位点，,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启 动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,2、Sextama 框：,35区，保守序列为TTGACA。Sextama 框是RN

12、A聚合酶中 的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。,Pribnow 框与Sextama 框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。,3、CAP位点：（乳糖操纵子的启动子序列）,CAP即分解代谢物基因激活蛋白(catabolite gene activation Protein)也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。,CAP分子内有两个结构域：羧基末端结构域是DNA结合区；氨基末端结构域是cAMP结合位点。CAP与cAMP的结合能提高CAP对双链DN

13、A的亲和力；CAP与启动子（CAP位点）的结合是激活乳糖操纵子转录的必要条件。,（二）终止子结构,提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）;终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。,原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于因子的转录终止；一类是依赖因子的转录终止；,两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。,两类终止子碱基组成的不同点：不依赖因子 回文结构富含G-C 下游富含A-T 依赖因子 G-C含量较少 下游无特征,类启动子分两部分：40 5 称为近启动子，决定转录起始的位点；16540 称为远启动子，影响转录的频率。,（一）RNA聚合酶的启动

14、子,即 rRNA 基因的启动子，称类启动子。,二、真核生物的启动子和终止子,真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同,（二）RNA聚合酶的启动子,1、帽子位点（cap site）：即转录起始位点，其碱基大多为 A。,2、TATA 框：又称Hogness 框，位于25 附近，由含有TATA 的67个核苷酸组成，保守序列为 TATA（A/T）A（A/T）。但TATA框的两侧富含G-C碱基对。,即 mRNA基因的启动子，称类启动子,核心启动子元件 作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。,3、CAAT 框：,位于

15、75 附近，保守序列为 GGNCAATCT。头两个 G 非常重要，一但突变，转录效率大大下降。,4、GC 框：,位于110附近，以5 CCGCC 3序列为特征。,上游启动子元件 作用：控制着转录起始的频率。,5、增强子（enhancer）：,能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。,增强子作用特点：增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。增强效应与其所处的位置和取向无关：增强子以53或 35排列对启动子都有作用。大多为重复序列：长约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。增强效应具有严密的组织和细胞特异性。没有基因专

16、一性。许多增强子受外部信号的调控。,五、RNA生物合成抑制剂,概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢 过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。,分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与DNA结合而改变模板的功能；3、与RNA聚合酶结合而影响其活力。,（一）利福霉素及利福平,作用：抗结核药物，特异地抑制细菌RNA聚合酶 的活性，因而抑制细菌RNA的合成。,机制：利福霉素可与RNA聚合酶的亚基结合，并阻止起始位点的填充，抑制二核苷酸 RNA的形成；利福平则阻止RNA聚合酶的移动，抑制 头三个核苷酸的形成。因此，利福霉素和利福平都是RNA链合成 起始过程的抑制剂。,

17、（二）利迪链菌素,作用：与细菌的RNA聚合酶亚基结合，抑制 转录过程中RNA链的延长反应。,一、mRNA的前体加工,1、5端形成 帽子结构(m7GpppNp)2、3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)3、中部剪接除去内含子4、链内部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,修饰的化学反应：,5-端的修饰在核内完成，且在转录到20个核苷酸时在转鸟嘌呤核苷酸酶催化下加到5端的。先于中段剪切。,5帽子分Cap0、Cap1、Cap2。,（一）5-端加上帽子结构(mGpppNp）,真核生物mRNA的5末端的第一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种

18、结构称为帽子（cap）。,mRNA帽子的生理功能：,帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体小亚基识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。,m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA)。,polyA的出现不依赖DNA模板。加尾信号：3-末端出现AAUAAA及下游的 GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内 切酶切除多余的核苷酸，然后加上poly A。尾部修饰和转录终止同时进行。3-端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段 的剪接。polyA的有无及长短是维持mRNA作为翻译模 板的活性，以及

19、增加mRNA本身稳定性的因素。,翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,蛋白质合成的场所是蛋白质合成的模板是模板与氨基酸之间的接合体是蛋白质合成的原料是,核糖体,mRNA,tRNA,20种氨基酸,一、遗传密码三联子,（一）三联子密码定义 mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(triplet coden)。,mRNA 5 GCU AGU ACA AAA CCU 3,（三）遗传密码的性质,1、简并性,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degener

20、acy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。,2、同工tRNA,（三）tRNA的种类,代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别（P112）。,无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突

21、变叫错义突变。GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）,在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。mRNA结合部位小亚基结合或接受AA-tRNA部位（A位）大亚基结合或接受肽基tRNA的部位大亚基肽基转移部位（P位）大亚基形成肽键的部位（转肽酶中心）大亚基,四、蛋白质合成的过程,氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止蛋白质前体的加工,(一)氨基酸的活化,第一节 基因操作的主要技术原理,1 核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，

22、它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。,7.PCR技术（基因的体外扩增法）,(1).概念 PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。,经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n个新生的DNA分子。,特别注意：,(2).一个PCR体系的基本组成,超纯水缓冲液Mg2+dNTPsDNA模板引

23、物TaqDNA聚合酶,作业:,1、用Sanger双脱氧链终止法进行DNA自动序列分析(即DNA测序分析)的原理。2、PCR技术原理。3、转化子的蓝白筛选原理。,原位杂交技术,原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为 RNA原位杂交 染色体原位杂交。,RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表

24、达产物做出定性定量分析。,6.4基因芯片及数据分析,基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。,一、原核生物基因表达调控总论,原核生物基因调控一般执行如下规律一个体系需要时被打开，不需要时被关闭。基因的开与关是相对的。开-关的活性可以通过转录水平上进行调节。,基因表达调控主要表现在二个方面,转录水平上的调控转录后水平上的调控,转录水平上的调控,负转录调控（negative trnscription regulation)调节基因的产物是阻遏蛋白

25、正转录调控（positive transcription regulation)调节基因的产物是激活蛋白,负转录调控,负控诱导 阻遏蛋白不与效应物结合时基因不转录。,负控阻遏 阻遏蛋白与效应物结合时，基因不转录。,正转录调控,正控诱导 有效应物时，激活蛋白处于活性状态基因转录。,正控阻遏 有效应物时，激活蛋白处于无活性状态基因不转录。,负控诱导,负控阻遏,正控诱导,正控阻遏,弱化子在操纵区与结构基因之间的一段可以 终止转录作用的核苷酸序列，称为弱化子。,B、弱化子对基因活性的影响,有葡萄糖的存在即使在培养基中加入乳糖、半乳糖等诱导物，操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用

26、。,C、降解物对基因活性的调节,当细菌生长过程中，氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生应急反应，停止全部基因的表达。产生应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp），是由空载的tRNA所引起的。,D、细菌的应急反应,空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，ppGpp的出现会关闭许多基因，PpGpp与pppGpp的作用能够影响一大批操纵子，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。,5、环腺苷酸受体蛋白对转录的调控,cAMP受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated pr

27、otein）。,二、乳糖操纵子,法国Jacob和Monod等人1961年提出(lac operon)学说。,Jacob,Monod,乳糖(lac)操纵子的表达调控,1、阻遏蛋白的负性调控没有乳糖时，1ac操纵子处于阻遏状态。i 基因在自身的启动子Pi 控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合。,2、CAP的正性调控,cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖供给能量时，cAMP含量降低；无葡萄糖时，cAMP含量升高。cAMP与CRP结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。,三、半乳糖（gal)操纵子,不同于lac操纵子,没

28、有葡萄糖时可以被诱导,有葡萄糖存在时gal也能被诱导，因此认为gal中可能存在两个启动子。,(二)弱化子及其作用,当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。这种调控现象与色氨酸操纵子特殊的结构有关。,先导序列含有3对反向重复序列，在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构，使转录终止。,、终止转录的作用（弱化机制）A.当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp量就少，使核糖体沿mRNA翻译移动的速度慢，赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度，这时核糖体占据1位的机会较多，使1、2不能配对，2、3配对

29、，阻止了3、4生成终止信号的结构，trp操纵元处于开放状态。,B.当色氨酸浓度增高时，核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快，占据到2段的机会增加，2、3配对的机会减少，3、4形成终止结构的机会增多，转录减弱。,C.当所有氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据1的序列，结果有利于1、2和3、4发夹结构的形成，于是转录停止。等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量”。,原核与真核生物基因表达的差异,Repeptitive gene Overlapping gene,Splitting gene no intron,DNA+histon

30、chromatin Naked DNA,回顾,原核生物与真核生物基因 表达调控机制具有惊人的相似性,共同的起源与共同的分子基础,调控机理上,调控层次上,真核生物主要采用正控制模式,无调节蛋白存在时，基因关闭有调节蛋白存在时，基因开启真核RNA pol 对其启动子的亲和性转录的启动是依赖多种激活蛋白的作用（与多个顺式元件结合）。,真核生物正调控的必要性和优越性,特异性:真核基因组很大,某种顺式元件出现的几率高。这种情况下,保证基因特异表达的方法之一是使用多个调控蛋白,并同时与顺式元件结合形成复合物,才能启动转录,而且必须是正调控。如果是负调控,只要有一个调控蛋白与顺式元件结合,即可关闭基因。一个

31、多细胞生物基因的调节位点(顺式元件)至少是5个。由于一种顺式元件可与多个调控蛋白结合,几个不同的顺式元件以适当有功能的方式排列在一起的随机性几乎没有，也保证了基因的特异性表达。经济:在分化了的细胞中,只须表达一部分(套)基因,其他的关闭。例如有100个基因,10%表达,90%关闭。如果是负控制,须90种阻遏物;如果是正控制,只须10种激活物，减轻蛋白质合成的负担。,真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：,第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控

32、的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。,真核基因组的一般构造特点,在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。,在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚

33、合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。,真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing），才能顺利地翻译成蛋白质。,(3)基因不连续性(interrupted gene),基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为不编码的序列所隔开。不连续基因是通过mRNA和DNA杂交试验发现的。外显子(exon)：编码序列 内含子(intr

34、on)：非编码序列外显子和内含子的概念与是否编码氨基酸的概念并不相对应。从不连续基因到成熟mRNA之间存在着一个基因转录的中间体,叫做初级转录物，叫做不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA),这个基因的初级转录物既含有外显子又含有内合子序列，从不均一核RNA到成熟mRNA要经过一转录后的加工拼接过程。真核生物基因的不连续性和转录后加工是真核基因有别于原核基因的又一重要特征。,真核生物DNA水平上的基因表达调控,分子生物学的最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物体的发育。高度重复基因的形成通常与

35、个体分化阶段DNA的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化。这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括了基因丢失、扩增、重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的，因为它使基因组发生了改变。,真核生物DNA水平上的基因表达调控,分子生物学的最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物体的发育。高度重复基因的形成通常与个体分化阶段

36、DNA的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化。这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括了基因丢失、扩增、重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的，因为它使基因组发生了改变。,基因重排,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。,真核生物最典型的例子是免疫球蛋白在成熟过程中的重排以及酵母的交配型转变.,DNA甲基化与基因活性的调控,DNA

37、甲基化是最早发现的修饰途径之一，这一修饰途径可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。大量研究表明，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。,DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中。实验证明，这个过程不但与DNA复制起始及错误修正时的定位有关，还通过改变基因的表达参与细胞的生长、发育过程及染色体印迹、X染色体失活等的调控。,增强子可能有如下3种作用机制：影响

38、模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录；将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动；增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶II进入染色质结构的“入口”。,增强子的作用原理是什么呢？,真核生物启动子和增强子是由若干DNA序列元件组成的，由于它们常与特定的功能基因连锁在一起，因此被称为顺式作用元件。这些序列组成基因转录的调控区，影响基因的表达。在转录调控过程中，除了需要调控区外，还需要反式

39、作用因子。一般认为，如果某个蛋白是体外转录系统中起始RNA合成所必需的，它就是转录复合物的一部分。根据各个蛋白成分在转录中的作用，能将整个复合物分为3部分：反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。与转录的起始或终止有关的辅助因子，不具有基因特异性。与特异调控序列结合的转录因子。它们中有些被认为是转录复合物的一部分，因为所有或大部分基因的启动区都含有这一特异序列。更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白，它们是起始某个（类）基因转录所必需的。,8.3 反式作用因子,反式作用因子

40、可以分为3类；(1)通用反式作用因子，主要识别启动子的核心启动成分，如TBP；（2）特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2；（3）和反应性元件（response elenents）相结合的反式作用因子。如HSE（热休克反应元件，heat shock response element），GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）；MRE（金属反应元件，metal response element）；TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response element);,(一)蛋白质直接和DNA结合,蛋白

41、质磷酸化、信号转导及基因表达,蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、神经递质的合成与释放甚至癌变等等。,蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化反应是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。,8.5 其他水平上的基因调控,8.5.1 RNA的加工成熟,各种基

42、因的转录产物都是RNA，无论是rRNA、tRNA还是mRNA，初级转录产物只有经过加工，才能成为有生物功能的活性分子。,rRNA和tRNA的加工成熟,rRNA加工有两个内容，一个是分子内的切割，另一个是化学修饰。真核生物的rRNA基因转录时，先产生一个45S的前体rRNA，然后被核酸酶逐渐降解，形成成熟的18S、28S和5.8S rRNA。,mRNA的加工成熟,编码蛋白质的基因转录产生mRNA。这类基因产物在转录后要进行一系列的加工变化，才能成为成熟的有生物功能的mRNA。这些加工主要包括在mRNA的5末端加“帽子”，在其3末端加上多聚（A），进行RNA的剪接以及核苷酸的甲基化修饰等。由于mR

43、NA的这些结构与它作为蛋白质合成模板的功能有密切关系，所以是基因表达的重要调控环节。与rRNA、tRNA相同，编码蛋白质的基因转录时首先生成前体pre-mRNA（或称核不均一RNA，hnRNA），然后再加工剪接为成熟mRNA。,真核生物基因转录后加工的多样性,真核生物的基因可以按其转录方式分为两大类：即简单转录单位和复杂转录单位。这两种转录方式虽然最终都产生蛋白质，但它们的转录后加工方式是不同的。,(1)简单转录单位。这类基因只编码产生一个多肽，其原始转录产物有时需要加工，有时则不需要加工。这类基因转录后加工有3种不同形式,第一种简单转录单位，如组蛋白基因，它们没有内含子，因此不存在转录后 加

44、工问题，其mRNA 3末端没有多聚（A），但有一个保守的回文序列作为转录终止信号。,第二种简单转录单位包括腺病毒蛋白IX，-干扰素和许多酵母蛋白质基因，它们没有内含子，所编码的mRNA不需要剪接，但需要加多聚（A）。,第三种简单转录单位包括-和-珠蛋白基因及许多细胞蛋白基因，这些基因虽然都有内含子，需要进行转录后加工剪接，还要加多聚（A），但它们只产生一个有功能的mRNA，所以仍然是简单转录单位。,8.5.2 翻译水平的调控,一.mRNA运输控制（transport control）是对转录本从细胞核运送到细胞质中的数量进行调节;二mRNA翻译的控制三mRNA的结构和翻译的效率四翻译的起始调节

45、五选择性翻译六反义RNA调控七翻译的自我调节,9.1 肿瘤与癌症,癌（cancer）是一群不受生长调控而繁殖的细胞，也称恶性肿瘤。良性肿瘤是一群仅局限在自己的正常位置，且不侵染周围其它组织和器官的细胞。绝大多数癌是由肿瘤细胞经过一系列突变转化而来的。,肿瘤细胞是永生化的、转化了的细胞,细胞癌变时发生三种类型的改变：永生化（immortalization）细胞克服了细胞分裂次数的限制无限增殖的特性。转化（transformation）指在转化的细胞中，不能观察到正常的细胞生长受限制，如转化细胞不依赖于通常能够刺激细胞生长和生存的因子,细胞变圆并长成一个集落(实体瘤)。转移（metastasis）

46、癌细胞获得了能够侵入正常组织的能力。它能够离开原来的组织，转移到机体的其他部分，并形成新的克隆。,癌基因（oncogene）可分为两大类：,病毒癌基因（viral oncogene，V-onc）:致瘤病毒中能在体内诱发肿瘤并在体外引起细胞转化的基因。编码病毒癌基因的主要有DNA病毒和RNA病毒。大约有15%-20%的癌症是由病毒感染引起的。原癌基因(细胞转化基因,cellular oncogene,C-onc):存在于细胞基因组中,正常情况下处于静止或低水平(限制性)表达状态，对维持细胞正常功能具有重要作用，当受到致癌因素作用被活化而导致细胞恶变的基因。,“基因领域”(gene territo

47、ry):,基因与基因之间的间隔距离。同一DNA链上两个具有相同转录方向的基因间隔小于一定长度时，影响有效转录所必需的染色质结构的形成，从而使这两个基因中的一个或两个均不能转录或转录活性显著降低，产生所谓基因领域效应（gene territorialeffect）。,9.6 基因治疗,人类疾病的发生，其实都是人体细胞中自身基因的改变或由外源病原体基因产物与人体基因相互作用的结果。基因治疗是将人的外源正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。,说明：1.穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物

48、体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB2192.YAC Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。3.BAC 细菌人工染色体。,三、人类基因组计划的科学意义,1.确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。2.了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。,5.发现与DNA复制、重组等有关的序列。6.研究DNA突变、重排和染色体断裂等。7.确定人类基因组中转座

49、子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。8.研究染色体和个体之间的多态性。,以人类基因组和拟南芥基因组为例说明你对生物基因组全序测定工作的科学意义与社会意义的认识（8分）中国科学院2002年 硕士学位研究生入学分子遗传学试题,四张图：物理图、转录图遗传图、序列图,四、HGP的主要任务,多态性：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性（Polymorphism）。,第三代DNA遗传标记，可能也是最好的遗传标记，是分散于基因组中的单个碱基的差异，即单核苷酸的多态性（single

50、nucleotide polymorphism，SNP），包括单个碱基的缺失、插入和替换。SNP中大多数为转换，即由一种嘧啶碱基替换另一种嘧啶碱基，或由一种嘌呤碱基替换另一种嘌呤碱基，颠换与转换之比为1：2。,2.DNA的鸟枪法测序的主要步骤,建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要超过一定值，并保证经末端测序的克隆片段的碱基总数达到基因组5倍以上。高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序。序列集合。填补缺口。,对鸟枪法的改进 克隆连续序列法Clone contig法。用稀有内切酶把待测基因组降解为数百kb以上的片段，再分别测序。靶标鸟枪法（direted