现代分子生物学生物信息的传递上复制.ppt

《现代分子生物学生物信息的传递上复制.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《现代分子生物学生物信息的传递上复制.ppt（95页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第三章 生物信息的传递（上）从DNA到RNA,以基因的形式荷载遗传信息，是生命遗传的物质基础。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存（DNA 复制）。作为基因复制和转录的模板，是个体生命活动的信息基础。DNA的生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生物个体性状（基因表达）。,DNA的基本功能：,基因表达(gene expression)：是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。,一、基本概念,生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录(transcription)：,转录

2、是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息从DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。,第一节 转录的基本原理,参与转录的物质,模板:DNA酶:RNA聚合酶原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)其他蛋白质因子,RNA合成方向：5 3,转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列为一个转录单元。DNA双链按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作反意义链或Waston链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为有意义链或Crick链。,5G C A G T A

3、 C A T G T C33 c g t c a t g t a c a g5,5G C A G U A C A U G U C3,N Ala Val His Val C,DNA,转录,mRNA,翻译,肽,DNA模板、转录产物mRNA 和氨基酸序列之间的关系,编码链,模板链,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,转录与复制的相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；都从5至3 方向延伸成新链多聚核

4、苷酸；都遵从碱基配对规律 但转录忠实性要低于DNA复制。转录与复制都受到严格的调控,二、转录与复制的异同,转录和复制的区别,引物 有 无高度进行性 中途不停止 可一段一段复制,（一）原核生物RNA 聚合酶,RNA聚合酶（大肠杆菌为例）,全酶=核心酶+因子,第二节 DNA指导下的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,RNA聚合酶,(二）真核生物RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶,定 位 核 仁 核 质 核 质转录产物 45s-rRNA hnRNA 5s-rRNA,tRNA,U1-13snRNA U6snRNA，（U6除外）非UsnRNA 对鹅膏蕈碱反

5、应 耐受 极敏感 中度敏感,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,第 三 节 与转录起始和终止有关的DNA结构,一、原核生物的启动子和终止子,启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,（一）启动子结构,转录单元,RNA聚合酶保护法分析启动子结构,Pribnow,41-44bp,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box)酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）,T A T A A T

6、Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,(Sextama box)提供了RNA聚合酶全酶识别的信号,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区序列分析,T85T83G81A61C69A52,T89A89T50A65A100,Pribnow 框,Sextama 框,1、Pribnow 框：,10区，保守序列为 TATAAT。Pribnow 框是RNA聚合酶的牢固结合位点，,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启 动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,2、Sextama 框：,35区，保守序列为TTGACA。Sextama 框是RNA聚合酶中 的识别位点，也是R

7、NA聚合酶的初始结合位点。,Pribnow 框与Sextama 框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。,3、CAP位点：（乳糖操纵子的启动子序列）,CAP即分解代谢物基因激活蛋白(catabolite gene activation Protein)也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。,CAP分子内有两个结构域：羧基末端结构域是DNA结合区；氨基末端结构域是cAMP结合位点。CAP与cAMP的结合能提高CAP对双链DNA的亲和力；CAP与启动子（C

8、AP位点）的结合是激活乳糖操纵子转录的必要条件。,乳糖启动子中有两个CAP结合位点：一个在 70 50位点，称位点；一个在 50 40位点，称位点。,位点包含一个反向重复序列，是强结合位点；位点是弱结合位点。,典型启动子的结构,-35-10 转录起点TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,（二）终止子结构,提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）;终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。,原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于因子的转录终止；一类是依赖因子的转录终止；,两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。,两类终止子碱基组成

9、的不同点：不依赖因子 回文结构富含G-C 下游富含A-T 依赖因子 G-C含量较少 下游无特征,转录方向,3,3,5,TCGGGCGAGCCCGC,CGCCCGAGCGGGCT,AAAAAATTT TTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAAUUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,不依赖因子 的终止子,转录方向,3,3,5,TAAGTAGATTCATC,CTACTTAGATGAAT,AGCTACTCGATG,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AGCTACUCGAUG,5,TCGATG,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,依赖因子 的终止子,

10、类启动子分两部分：40 5 称为近启动子，决定转录起始的位点；16540 称为远启动子，影响转录的频率。,（一）RNA聚合酶的启动子,即 rRNA 基因的启动子，称类启动子。,二、真核生物的启动子和终止子,真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同,（二）RNA聚合酶的启动子,1、帽子位点（cap site）：即转录起始位点，其碱基大多为 A。,2、TATA 框：又称Hogness 框，位于25 附近，由含有TATA 的67个核苷酸组成，保守序列为 TATA（A/T）A（A/T）。但TATA框的两侧富含G-C碱基对。,即 mRNA基因的启动子，称类启动子,核心

11、启动子元件 作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。,3、CAAT 框：,位于 75 附近，保守序列为 GGNCAATCT。头两个 G 非常重要，一但突变，转录效率大大下降。,4、GC 框：,位于110附近，以5 CCGCC 3序列为特征。,上游启动子元件 作用：控制着转录起始的频率。,5、增强子（enhancer）：,能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。,增强子作用特点：增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。增强效应与其所处的位置和取向无关：增强子以53或 35排列对启动子都有作用。大多为

12、重复序列：长约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。增强效应具有严密的组织和细胞特异性。没有基因专一性。许多增强子受外部信号的调控。,（三）RNA聚合酶 的启动子,即 tRNA基因的启动子，称类启动子。,类启动子位于转录起始点下游，称下游启动子或内部启动子。,类启动子包括：A盒、B盒 A盒靠近5方向；B盒 靠近3 方向。,类启动子需要的转录因子包括：TF C、TF B、TF A，前两者是共同的，后者为5S rRNA基因转录所需。,三、原核生物和真核生物转录起始位点的结构差异,图5-4 P155页,原核生物与真核生物启动子比较,原核生物和真核生物转录及抑制剂,第

13、四 节,原核生物转录的起始 原核生物转录的延长 原核生物转录的终止与新合成RNA链的释放 真核生物的转录 RNA生物合成抑制剂,转录起始需解决两个问题：DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。,一、原核生物转录的起始,4.当三元复合物中RNA长69个核苷酸时，因子从全酶解离下来，进入延长阶段。,2.RNA聚合酶向10区转移，并与之牢固结合。10区DNA双链解开1217bp，形成开放的二 元启动子复合物（模板酶）。,转录起始过程,1.因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列），RNA聚合酶全酶(2)与模板35序列结合，形成闭合的二元闭合

14、启动子复合物。,3.在RNA聚合酶亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板酶RNA）。转录复合物：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,二、原核生物转录的延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，以模板链作指导，按照碱基配对原则：A-U，T-A，G-C；NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,延长中的转录复合物也叫转录空泡。随着RNA聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。原核生物的转录和翻译偶联进行。,转录空泡(

15、transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,三、原核生物转录的终止和新生RNA链的释放,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类：,不依赖Rho()因子的转录终止依赖Rho()因子的转录终止,（一）依赖 因子的转录终止,1969年，Roberts发现了能控制转录终止的蛋白质，即因子。由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。,因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促使转录三元复合物解离的根本原因。因子的NTP酶活性依赖于

16、单链RNA的结构。,因子依赖性终止子含有一个反向重复序列，使 RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕，因子得以发挥作用，终止转录。,水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,（二）非依赖 因子的转录终止,DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集 的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回 文结构。转录产物RNA的3-末端有若干个连续的U。连续U区的5-端前方碱基形成茎环结构或发 夹结构。这种二级结构是阻止转录继续向下 游推进的关键。,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；密集A-U 配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。终止效率与二重

17、对称序列和寡聚U的长短有关。,四、真核生物的转录,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子，与模板结合形成转录起始前复合物，其起始过程比原核生物复杂得多。,真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物,转录因子 转录复合体TBPTAFsTFIIATFIIB TFIIF Pol IITFIIE、,真核生物转录起始复合物,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以

18、观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,（三）转录终止,1、RNA聚合酶转录出rRNA前体3末端后，继续向下游转录超过1000个bp时，存在一个 18bp的终止序列。2、RNA聚合酶 转录模板的下游存在一个 终止子，是位于GC丰富序列之中的TTTT。RNA聚合酶有内原性的转录终止功能。3、RNA聚合酶的转录没有明确的终止信号。,五、RNA生物合成抑制剂,概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢 过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。,分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与DNA结

19、合而改变模板的功能；3、与RNA聚合酶结合而影响其活力。,（一）利福霉素及利福平,作用：抗结核药物，特异地抑制细菌RNA聚合酶 的活性，因而抑制细菌RNA的合成。,机制：利福霉素可与RNA聚合酶的亚基结合，并阻止起始位点的填充，抑制二核苷酸 RNA的形成；利福平则阻止RNA聚合酶的移动，抑制 头三个核苷酸的形成。因此，利福霉素和利福平都是RNA链合成 起始过程的抑制剂。,（二）利迪链菌素,作用：与细菌的RNA聚合酶亚基结合，抑制 转录过程中RNA链的延长反应。,转录后加工过程及其机制,第五节,mRNA的前体加工 rRNA的前体加工 tRNA的前体加工,真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，

20、即无活性，亦无功能。真核初级转录产物必须在胞核内经过适当加工，使之变成具有活性的成熟RNA后，由胞核运至胞 质才能执行翻译功能。真核细胞转录作用和翻译作用无论在空间上还 是时间上都是彼此分开进行的。原核细胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA加工。,真核细胞与原核细胞转录产物的区别：,一、mRNA的前体加工,1、5端形成 帽子结构(m7GpppNp)2、3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)3、中部剪接除去内含子4、链内部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,修饰的化学反应：,5-端的修饰在核内完成，且在转录到20个核苷酸时在转鸟嘌呤核苷酸酶催化下加到5端的。先于

21、中段剪切。,5帽子分Cap0、Cap1、Cap2。,（一）5-端加上帽子结构(mGpppNp）,真核生物mRNA的5末端的第一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。,由稀有的7-甲基鸟嘌呤通过5,5三磷酸键与初始转录物的起始（5）核苷酸连接形成的。,转鸟嘌呤核苷酸酶催化,尿苷酸-7甲基转移酶,2-O-甲基转移酶,（cap1）,（cap0）,（cap2）,2-O-甲基转移酶,mRNA帽子的生理功能：,帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体小亚基识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。,m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护m

22、RNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA)。,polyA的出现不依赖DNA模板。加尾信号：3-末端出现AAUAAA及下游的 GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内 切酶切除多余的核苷酸，然后加上poly A。尾部修饰和转录终止同时进行。3-端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段 的剪接。polyA的有无及长短是维持mRNA作为翻译模 板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。,约20NT,第一步：CPSF识别AAUAA信号，CstF结合GU/U区，激活CF核酸酶，发生断裂,CPSF:断裂识别因子,CstF:断裂刺激因子,第二步：PAP结合

23、到断裂点，聚合约个腺苷酸的poly（A）尾巴，这个短的尾巴通过寡聚腺苷酸结合蛋白刺激PAP活性再进一步延伸到大约200个腺苷酸。,聚腺苷酸聚合酶（PAP）,mRNA3-端的多聚腺苷酸化可被冬虫夏草素（3-脱氧胸苷）所阻止；即冬虫夏草素是多聚腺苷酸化的特异抑制剂。,（三）mRNA的甲基化,真核生物mRNA分子中有许多甲基化的碱基，主要是：N6-甲基腺嘌呤（m6A）。,（四)mRNA的自我剪接,自我剪接的概念,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为剪接体，进行剪接；参与mRNA剪切的snRNP包括U1、U2、U4、U5、U6,内含子上有3个保守性序列剪接位点：5端

24、起始序列GU；3端AG;距3端1840个核苷酸处有一个“分支点”，一定含A，由A发动第一次转酯反应。剪接过程是两次转脂反应。与类内含子相似。,5.AAGUAAGU.CURAY.(10-40)(U/C)11NCAG G.3,Intron,exon,exon,Polyprimidine,CAG=UAG AAG GAG,GU-AG、AU-AC：真核生物细胞核mRNA基因 类内含子：线粒体、叶绿体及低等真核生物细胞核的rRNA基因 类内含子：线粒体、叶绿体的mRNA基因,生物体内内含子的主要类型：,类内含子的自我剪接,类内含子的自我剪接,组成型剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA

25、。选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA。,组成型剪接和可变剪接,顺式和反式剪接,内含子剪接一般都是发生在同一基因内，切 除内含子，相邻的外显子彼此连接，这种剪 接称为顺式剪接（cis-splicing）。,反式剪接（trans-splicing）则是指发生在不 同基因之间的外显子的剪接。,反式剪接发现于几种锥虫和线虫中。都是在 mRNA 5端存在前导序列，称剪接前导RNA（splicing leader RNA，sl RNA）。sl RNA的反式剪接表现了核内剪接系统的进化。,（五）RNA的编辑,概念：指转录产物RNA前体编码区发生碱基的突变、插入或丢失等现象。,近

26、年发现某些mRNA前体的核苷酸序列需加 以改编，才能变成正确的有翻译活性的模板。mRNA的这种编辑作用广泛存在于原生动物及 植物细胞的线粒体。,C变为U,非碱基的突变DNA水平转换的频率远高于突变,6666位,mRNA编辑,尿苷酸的缺失和添加,在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。,锥虫coxII 基因的编辑,在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，,RNA编辑是基因转录后在mRNA中插入、缺失或核苷酸的替换而改变DNA模板来源的遗传信息，翻译出多种氨基酸序列不同的蛋

27、白质。RNA编辑的结果不仅扩大了遗传信息，而且使生物更好地适应生存环境。有些基因的主要转录产物必须经过编辑才能有效地起始翻译，或产生正确的可读框(ORF)。,二、rRNA前体的加工,原核细胞与真核细胞的rRNA前体都需加工：,1、原核细胞 rRNA 基因与某些 tRNA 基因构成 混合操纵子。大肠杆菌共有7个转录单位，每个转录单位 由16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA及 一个或几个tRNA基因组成。,rRNA前体被大肠杆菌RNase,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基,2、原核生物rRNA转

28、录后加工，包括以下几方面：,大肠杆菌rRNA前体的加工,2、真核细胞 rRNA 基因为串联重复序列：由18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA基因 组成一个转录单位，彼此被间隔区分开。,每个重复单位之间的间隔DNA序列不转 录，称为非转录间隔序列。,真核生物 5S rRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域，它由RNApol 转录，加工成熟后构成核糖体大亚基。,不同生物的 rRNA 前体大小不同：哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S,18S,5.8S,28S,18S-rRNA,5.8S和28S-rRNA,内含子,45S转录产物,剪 接,终产物,rDNA,

29、基因间隔,哺乳动物细胞 rRNA 前体加工过程,tRNA前体,三、tRNA前体的加工,原核与真核tRNA基因大多成簇存在。,tRNA前体的加工包括：剪切内含子 核酸外切酶修剪3末端，逐个切去附加序列；加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。碱基修饰,RNaseP：5端修剪 RNaseD：3端修剪 RNase连接酶,1、剪切内含子：属于酶促反应，需要酶及ATP。,tRNA核苷酸转移酶,2、加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。,3、碱基修饰,转录物前体形成茎环结构RNase E、F切割3端RNase D对3端修剪RNaseP 对5端切除RNase D再除去3端的两个核苷酸 tRNA进行碱基修饰,