现代分子生物学-蛋白质.ppt
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1、,蛋白质互作Protein-protein interaction,1.蛋白质互作研究的意义2.蛋白质互作(事例)3.细胞内蛋白质标记4.其他进展,References:Bruce Alberts et al,Molecular Biology of the Cell(5th edition),Garland Science Erica Golemis et al,Protein-protein InteractionA Molecular Cloning Manual papers,1.蛋白质互作研究的意义(Importance),生命活动 细胞活动:基因是关键,基因表达调控,与其它分子结合
2、:信号转导,转录,蛋白质:修饰,翻译,蛋白作用,单个蛋白:较少,蛋白复合体,动态,蛋白质相互作用:结构,最具挑战性,分子水平:基因组DNA:基因重排,Ig多样性 基因序列多样性(Science.2004,305:251-254),抵抗 不同病原(低等动物)等作用 DNA修饰,甲基化(epigenomics),S修饰等mRNA:启动子,ChIP,EMSA 非编码小RNA(siRNA,miRNA,piRNA)(epigenomics)蛋白质:蛋白质互作(蛋白质组学)蛋白质结构(工具,生物信息学)蛋白质标记(细胞固定,活细胞标记)异构体,2.蛋白质互作(protein-protein interac
3、tion)事例,病毒-对虾蛋白互作 经济模式动物,White spot syndrome virus(WSSV),对虾:无脊椎动物,仅有先天性免疫系统,无特异性免疫,体表阻挡,细胞系统:吞噬细胞、细胞凋亡,体液防御系统:干扰素、抗病毒肽、凝集素等,无脊椎动物免疫系统,1)概述开始研究前,必须了解研究背景,(1)模式识别:模式识别因子(2)信号转导:受体藕联蛋白 信号转导(3)抗病毒效应:干扰素,抗病 毒肽,细胞凋亡,细胞吞噬。,蛋白质互作,非特异性免疫,特异性免疫,Nature 2005,434:27,蛋白质互作,如何开始研究?,抗病对虾:mRNA差异显示技术(DD-PCR),抑制差减杂交,亲
4、和层析,70个对虾抗病相关基因,其中30个新基因,2)对虾抗病毒相关功能基因筛选,Rab6:抗病毒对虾中上调表达 说明在抗病毒免疫反应中起作用 重要的小G蛋白,小G蛋白:GTPase,20-25 kDa,5个家族Ras:细胞生长调节Rho:actin细胞骨架重组,基因表达调控Rab:膜性颗粒的锚定与融合Arf:调节膜性颗粒的运输Ran:调控核内运输,胞质,细胞核,Rab蛋白在体内以两种构象形式存在,活化的Rab蛋白为GTP结合形式,位于 胞膜;未活化的Rab蛋白与GDP结合,位于胞浆。,Cell,2007,129:865,Thierry Galvez et al.2012.Cell 151:2
5、34,Rab蛋白:所有的真核生物中都有Rab蛋白 酵母中的Rab蛋白称为Ypt蛋白,7个Rab蛋白 线虫(C elegans)29种Rab蛋白 果蝇(Drosophila melanogaster)26种Rab蛋白 拟南芥(Arabidopsis thaliana)57种Rab蛋白 人有60多种Rab蛋白,PM1-3,G1-3:与GTP结合/分解相关的保守区,G结构域F1-5:Rab的保守区高度可变的N端和C端,G结构域:6个折叠(1-6),5个螺旋(1-5)和5个多肽环。多肽环:折叠与螺旋之间由多肽环连接 氨基酸序列高度保守 Mg2+和鸟嘌呤的结合位点,同时催化 GTP水解 开关I和开关II
6、:Rab蛋白与它的GEF和GAP的关 键位点,Rab6在抗病毒对虾中上调表达,参与抗病毒免疫反应,参与免疫的途径?,筛选与Rab6结合的蛋白质,蛋白互作,GST pull-down,CoIP,酵母(细菌)双杂交,噬菌体展示,蛋白质芯片,Native/SDS-PAGE,蛋白质鉴定,蛋白互作验证,功能,3)互作蛋白筛选,His tag,SDS-PAGEWestern blot,Co-Immunoprecipitation(CoIP),不受互作蛋白结合位点影响蛋白条带较多,Yeast 2-Hybrid Assay,细菌双杂交,文库筛选,检测2个蛋白互作,噬菌体展示,蛋白质芯片,4)互作蛋白的鉴定,N
7、端测序:Edman sequncing 需要大量纯化的蛋白质 N末端封闭质谱(masspectrometry,MS)分析 常用,基因组序列,MALDI-TOF MS:matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flightESI-MS/MS:nano-electrospray ionization tandem MS(Q-TOF)MALDI-Q-TOF,TOF/TOF,生物样品离子化方法,5)蛋白互作的验证,体外:Western blot体内:细胞试验,酵母(细菌)双杂交,6)功能体内,RNAi抑制Rab6基因的表达对血细胞吞噬功能的
8、影响,Rab6基因过量表达对血细胞吞噬功能的影响,Rab6基因沉默对病毒感染的影响,VP466,Rab,tropomyosin,actin,900-1020 bp,互作片段,信号通路 VP466-tropomyosin-actin,VP466:感染必需蛋白,信号通路VP466-Rab6-actin,Rab6 N端:与VP466互作必需,体外,体内,VP466为Rab6的GAP,信号通路VP466-Rab6-actin,VP466激活Rab6,Rab6影响actin构象,促进吞噬,信号通路VP466-Rab6-actin,果蝇:Rab6-actin,果蝇:Rab6-actin,VP466,Ran
9、,myosin,actin,细胞吞噬,细胞吞噬 Ran,tropomyosin,Rab,RNAi,overexpression,N,P,小分子siRNA,小G蛋白(Rab,Ran)与骨架 蛋白直接作用调控吞噬病毒双功能蛋白,蛋白质复合体标记,病毒感染 Rhodamine-Phalloidin,3.细胞内蛋白质标记(protein labeling in vivo),蛋白质互作:生化数据,体外分析细胞、个体观察:蛋白质标记,荧光标记(fluorecence labeling)常用:小分子有机染料与各种抗体相连接或特异的荧光标记物,研究 各种目的蛋白 需要对细胞进行固定等操作 进展:直接在活体细胞
10、内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧 光标记物 荧光蛋白:非侵入性的活体细胞成像 荧光蛋白-目的蛋白融合表达:过量表达 目的基因失活突变体(株),1)荧光标记物2)标记蛋白技术 3)应用,1)荧光标记物,小分子有机染料分子量小于1KD与生物大分子共价连接对其进行标记染料的最佳检测波长范围、亮度,即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性利用:扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类 吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。有数百种荧光染料商品,如DAPI,FITC,Rhodamine,Hoechst,PI,DTAF,phalloidin等多与抗体联用,荧光蛋白 最早:藻胆蛋白(phy
11、cobiliproteins),蓝藻中提取的触角光合色素 含有多种胆汁三烯生色基团,生色基团包裹在一种基质结构中,将它们的淬灭作用降至最小,因此这些藻胆蛋白的荧光亮度 要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。蛋白分子量200KD,限制了它们在细胞内的扩散,只能与抗体联 用,在流式细胞或ELISA中用来检测细胞表面的蛋白质分子 后来:维多利亚发光水母(Aequorea victoria)中发现GFP,生物成像 发生革命性改变,单独表达GFP或与其它蛋白融合表达,GFP,依赖钙离子,荧光蛋白(GFP,RFP,YFP,CFP)大都来自海洋腔肠动物 荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感
12、,但 酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光,量子点(Quantum Dot)(2000)无机纳米结晶体,冷光半导体纳米颗粒可根据其大小发出特定波长的荧光,具有非常高的消光系数(比小分子 荧光基团和荧光蛋白高出10-100倍),量子产率也非常好典型的量子点都含有一个硒化镉(CdSe)或碲化镉(CdTe)核心,外面 包裹一硫化锌(ZnS)外壳吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围,一束 单波长激发光就可以让量子点达到多重发射量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)等分子相连,但结合生物大分子的量子点体积过大(直径约10-30nm),阻碍它通 过细胞膜结构,
13、只能用于经透化处理的细胞或只能对胞外蛋白和可 被细胞内吞的蛋白进行研究量子点的光稳定性使其能够反复成像,其大小和电子密度特性又使得它适 合用于电镜研究在亲水的树枝状高分子聚合物中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光,也具有波长可调性,这种新型材料可望在细胞生物学领域应用,应用限制:与生物大分子连接,体积大,量子点结构模式图,量子点与抗体及生物素连接模式图,Color Qtracker 细胞标记效果3T3细胞(绿色),HeLa细胞(红色),U188细胞(白色)分别用 Qtracker 565,655,和705 进行了荧光标记,纳米颗粒Bruce E.Cohen.2010.Nature 467:40
14、7-408有机纳米颗粒:钛酸钡(BaTiO3)可代替无机荧光染料 用于活组织的成像荧光染料成像原理:荧光分子吸收光,发出比吸收光能量低的荧光 吸收光与散射光的能量差异称为Stokes shift,保证发出荧光荧光染料的缺点:1)细胞本身有许多荧光分子,产生荧光背景 2)荧光显微镜的激发光可能损伤细胞,如紫外光 等;光损伤可能间接发生,荧光分子与其它分 子发生反应解决荧光染料的缺点:构建双光子显微镜(two-photon microscope)采用脉冲近红外线激光,发出比激发光能量高 的光该文:采用第二次谐波产生技术 发现barium titanate(BaTiO3)晶体(纳米颗粒),30 nm
15、 比核糖体的直径大2倍 有望代替荧光染料的材料:量子点和纳米颗粒,活细胞染色染料Invitrogen product listC10106 Cellular Lights Tubulin-GFP*BacMam 1.0*C10112 Cellular Lights Tubulin-RFP*BacMam 1.0*C10126 Cellular Lights Actin-GFP*BacMam 1.0*C10127 Cellular Lights Actin-RFP*BacMam 1.0*O10100 Organelle Lights Lysosomes-RFP*BacMam 1.0*O10104 O
16、rganelle Lights Endosomes-GFP*BacMam 1.0*O36210 Organelle Lights Mito-GFP*BacMam 1.0*O36231 Organelle Lights Endosomes-RFP*BacMam 1.0*P36232 Premo FUCCI Cell Cycle Sensor*BacMam 1.0*P36235 Premo Autophagy Sensor LC3B-GFP*BacMam 2.0*P36236 Premo Autophagy Sensor LC3B-RFP*BacMam 2.0*,2)标记蛋白技术,免疫标记法检测内
17、源性蛋白最常用方法用特异性抗体(一抗)识别靶蛋白,再用标记有小分子有机染料、藻胆 蛋白或量子点的二抗显色;或者,直接将荧光标记物或生物素连接 在一抗上,然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。如果没有高质量的抗体,可将荧光标记物与靶蛋白融合过量表达缺点:该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可被细胞内吞的 蛋白;抗体标记物的多价性可能会导致靶蛋白形成寡聚体 荧光标记复合体通常分子量会超过200KD,可能影响蛋白互作,+、+/-、-分别表示“应用范围较广”,“在某些领域内有所应用”,“较少应用”,遗传标记法荧光蛋白与靶蛋白融合表达,转染、转基因缺点:表达的蛋白不是内源性蛋白 荧光蛋白分子大小会影响目
18、的蛋白功能 荧光蛋白的限制性改进:靶基因突变株或RNAi 活细胞内或细胞表面将小分子荧光标记物与目的蛋白共价连接或 通过酶进行连接 例:四半胱氨酸序列(tetracysteine)-biarsenical染料系统 12aa肽段(含4Cys),Cys与透过细胞膜的biarsenical染 料结合(高亲和力),形成FlAsH或ReAsH,发出绿色或 红色荧光 同时使用小分子二巯基化合物解毒剂可降低靶蛋白与染料 间亲和力,减少毒性反应 Tetracysteine对目的蛋白的影响比荧光蛋白小得多 可用于亲和纯化、荧光蛋白辅助的光灭活作用、检测蛋白 质合成过程、进行脉冲追踪标记、电镜定位等 biarse
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- 现代 分子生物学 蛋白质
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