环境毒理学常用实验方法.ppt
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1、环境毒理学常用实验方法,急性毒性实验蓄积性毒性实验亚慢性和慢性毒性实验致突变试验致畸试验致癌试验,毒理学 实验基础,实验动物(laboratory animal)经人工培育,对其携带微生物实行控制,遗传背景明确,来源清楚,可用于科学研究的动物。温血动物(恒温动物)兔、豚鼠、大鼠、小鼠 有时也用猴、狗、猫等,实验动物的选择,狗,小鼠,大鼠,豚鼠,仓鼠,实验动物的选择,种属的选择 个体选择 年龄 体重 性别 生理状态 健康状况,实验动物的选择,种属的选择 机体反应上尽量近似于人体;易获得、易饲养、易管理;最敏感、最合适;选用几种不同种属的动物(对毒作用不清楚的化学物质);借助已有毒理学研究资料选择
2、。,实验动物的选择,借助已有毒理学研究资料选择 气体、蒸气对粘膜的刺激作用猫 毒物对皮肤的局部作用豚鼠或兔(皮肤对刺激物的反应近似于人)过敏性反应豚鼠(易于致敏)观察致呕吐作用的实验研究狗、猫 外界环境因素引起机体体温过高及体温过低的反应兔或猫(大鼠、小鼠对于体温调节不稳定)高血压病理狗、兔、大鼠(易出现血压变化)物质的致癌作用小鼠和大鼠 慢性中毒损害实质性脏器的毒物小鼠(实质性脏器容易罹患病变),个体选择,年龄 除特殊要求外,动物年龄一般选用初成年者。性别 根据目的,若对动物性别无特殊要求,宜选用雌雄各半。生理状态怀孕、哺乳 通常实验均不宜采用处于特殊生理状态的动物进行,为了某种特定的实验目
3、的除外。健康状况 所用动物进入实验室后,于实验开始前应观察一周以上,以删除不健康的动物,并使实验动物适应环境。,实验动物的选择,常用染毒途径和方式,(1)经口 灌胃、喂饲、吞咽胶囊(2)经呼吸道 动物自行吸收(静式吸入染毒、动式吸入染毒)人工动物气管注入(3)经皮肤(4)其它途径 注射途径,常用染毒途径和方式,(1)经口染毒 灌胃 用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内;直接灌入胃内,不与口腔及食道接触;给予的化学物剂量准确。喂饲 将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中,使动物自行摄入含化学物的饲料或水,然后依每日食入的饲料与水再推算动物实际摄入化学物的剂量。,常用染毒途径和方式,(1)经
4、口染毒 优点:接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式,方法简便、易操作。缺点 进食时浪费、损失饲料多,摄入的量不准确;如果化学物有异味,动物可能拒食;如果化学物在室温下可以挥发,或在饲料中和水中可以水解,则剂量也不准确;有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能;更适宜进行多日染毒,急性毒性试验一般不用之。,(1)经口染毒 吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内,强制放到动物的舌后咽部迫使其咽下。此法剂量准确,尤其适用于易挥发、易水解和有异臭的化学物。兔、猫及狗等较大动物可用此法。,常用染毒途径和方式,(2)经呼吸道染毒 凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能,在生产过程中形成
5、气溶胶的化学物也可经呼吸道吸入。类型:动物自行吸收 静式吸入染毒 动式吸入染毒 人工动物气管注入 人工动物气管注入将液态或固态外源化学物注入肺内。这是一个手术过程,仅适用于制造化学物对肺脏损伤模型的制备,而不用于一般毒性研究。,常用染毒途径和方式,静式吸入染毒 在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物,造成含一定浓度受试物的空气环境,使受试动物在规定时间内,经吸入而达到染毒,适用于短时间染毒的试验。动式吸入染毒 采用机械通风为动力,连续不断地将含有已知浓度受试物的新鲜空气送入染毒柜内,并排出等量的污染气体,使染毒浓度保持相对稳定,这样可使染毒时间不受染毒柜(室)容积的限制,也可避免动物缺氧、CO2
6、积聚、温度增加等对试验结果的可能影响,适用于较长时间以及反复染毒的试验使用。,常用染毒途径和方式,(3)经皮肤染毒 液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会。能经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式经过皮肤角质层屏障,在表皮角质细胞的间质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤,角质层薄的皮肤部位更易吸收。,常用染毒途径和方式,实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异常现象,剔除不合格动物。染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量。接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿。,常用染毒途径和方式,成年动物年老动物表皮厚度、细胞成分改变为保证不因皮肤部位不同而形成的化学
7、物渗透率差异,一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤。面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定。(如家兔可取5cm6cm、豚鼠取3cm4cm、大鼠取1.5cm2.0cm直径的面积,小鼠取1.0cm1.5cm直径的面积。),(3)经皮肤染毒,(4)其它途径染毒 有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究,或进行一些必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救药物筛选等),往往用注射途径染毒。静脉注射:大鼠、小鼠尾静脉,兔耳缘静脉 注射途径 肌肉注射 皮下注射 腹腔注射:小动物,常用染毒途径和方式,动物实验的一般操作方法,急性毒性试验,一、急性毒性的概念,急性毒性是指机体(人或实验动物)一次
8、或24h之内多次接触(染毒)外源化学物之后,在短期内所发生的毒性效应,包括引起死亡效应。一次:瞬间染毒,如经口染毒、经注射途径染毒,但在经呼吸道与经皮肤染毒,则是指在一个特定的期间内持续地接触化学物的过程,“一次”含有时间因素。多次:当外源化学物毒性过低,或一次染毒剂量受机体容量限制,需给予实验动物较大剂量时,则可在24h内分次染毒。,二、急性毒性试验的目的 探求化学物的致死剂量,以初步评估其对人类的可能毒害的危险性;求该化学物的剂量-反应关系,为其它毒性实验打下选择染毒剂量的基础。,表示急性毒性大小:LD50,急性毒性试验,三、急性毒性试验的内容(1)急性毒性测定 确定一次染毒的 LD50或
9、LC50;(2)经皮肤染毒实验 考察受检化学物质能否经皮肤进入体内,LD50;(3)局部作用实验 通过使受检化学物质直接接触皮肤及眼结膜等试验,研究其对生物体局部有无刺激、腐蚀及其他危害作用。,急性毒性试验,三、急性毒性试验的内容(4)中毒症状的观察 据染毒动物症状及体征,粗略了解毒物作用的程度和可能作用部位。(5)功能及病理组织学检查 选择必要的功能指标,寻求毒作用剂量与功能改变的关系,确定急性阈剂量;通过病理组织学检查,进一步了解毒作用部位及毒害程度。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(一)半数致死量(LD50、LC50)的测定1.动物准备一般采用小动物,如小鼠、大鼠、豚鼠等。实验
10、动物应预先观察7天左右,以了解其健康情况及正常活动状态。正式实验时,按随机分组原则分组,一般分成56个实验组(必要时备对照组),每组510只动物(小鼠多用10只)。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(一)半数致死量(LD50、LC50)的测定2.剂量选择先查阅文献中与受试物的类似物LD50或LC50;以3倍之差的三个剂量组进行预实验,每组3只动物,求出动物全活、全死剂量;在预试验的全活全死剂量之间设56个剂量组,各组间剂量差距常按等比级数1.21.5设计。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(一)半数致死量(LD50、LC50)的测定3.药液配制及染毒给药的剂型溶解性水溶液、混悬
11、液、油剂或乳剂在非吸入染毒实验中,多按单位体重给予等容量药液的方法给药,可以保证不同剂量组动物接受相同容量的药液。如配制实验用液中用到新溶剂、新助剂,或实验终结时需作病理组织学观察时,则应有对照组。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(一)半数致死量(LD50、LC50)的测定4.症状观察染毒开始后应观察并记录实验动物的中毒表现、生理状况变化和死亡情况。观察时间可确定为几小时、几天、一周或两周,但一般不超过二周(二周内)。,急性毒性试验,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(一)半数致死量(LD50、LC50)的测定5.病理学检查观察器官是否有血、出血、水肿或其他变化,并对有变化的脏
12、器作病理组织学检查。对存活动物在观察期满后也应做病理学检查。6.结果评价计算半致死剂量或浓度:确定绝对致死剂量或浓度、最小致死剂量或浓度和最大耐受剂量或浓度。急性毒性进行评定:与同系物或其他毒物比较,与毒性分级比较分析。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(二)急性阈剂量的测定 急性阈剂量指毒物经一次染毒后对机体产生不良作用的最小剂量,是用于评价毒物非致死性损害的参数。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验(二)急性阈剂量的测定 1.观察指标的选择 应根据毒物和实验动物的特性采用不同的生理、生化及形态学的指标。(1)对于新化学物质,首先选用整体状态及非特异性作用指标,如活动能力、应激
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