植物组织或器官中丙二醛含量的测定.ppt
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1、植物组织或器官中丙二醛含量的测定,制作人:刘新 单 位:生命科学学院 植物生理学教研室,一、实验目的,1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。2.了解丙二醛积累对细胞的伤害,二、实验原理:,逆境,膜脂的过氧化作用,丙二醛,酸性,粉红色,三、实验材料:,受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官(以正常条件下的作为对照):,实验仪器:,紫外可见分光光度计 离心机,四、实验步骤:,1 MDA的提取 称2g叶片,加入5ml 磷酸缓冲液(50mmol,pH值为7.8)及少量石英砂,于冰浴中研磨提取,匀浆液以12000g 离心力作用下(4度)离心10min,其上清液即为MDA提取液。2
2、MDA的测定 取1ml MDA提取液,加3ml 27三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在95度水浴中保温30min后,立即置于冰浴中冷却,然后离心10min,于波长532nm和600nm下测定OD值。,五、结果计算,以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值,按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。分别计算衰老和对照组的值。MDA浓度(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(mol/g FW)D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。,六、注意事项:,的三氯乙酸对MDATBA反应较合适,若高于
3、此浓度,其反应液的非专一性吸收偏高;MDA-TBA显色反应的加热时间,最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降;如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机离心。低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应,当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+(最终浓度为0.5 nmolL-1)可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收(最大吸收在450 nm),当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高,必要时要排除可溶性糖的干扰。,思考题:,1.通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题?2.说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。3.TBA为什么要溶解在三氯乙酸中?4.为什么要测定反应液在600nm下的吸光度?5.丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果?6.如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定,你有什么办法消除其影响?7.正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化,分析其原因。,
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