植物组织培养的试验设建设和离体操作技术.ppt

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1、第一章 植物组织培养实验室的建设和离体操作技术,目 录,第一节 植物组织培养的概述 第二节 植物组织培养实验室的建设 第三节 培养基 第四节基本操作技术,第一节 植物组织培养的概述,植物组织培养的几个基本概念植物组织培养的分类植物组织培养的发展历史植物组织培养的应用,一、植物组织培养的概念,植物组织培养（Plant tissue culture）通过无菌操作，把植物体的器官、组织、细胞甚至原生质体，接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养，使之生长、繁殖或长出完整植株的技术和方法。用来培养的材料即外植体通常是离体的，所以又叫植物离体培养(plant in vitro cultu

2、re)。外植体(Explant)从活体上切取下来用于培养的 那部分组织、器官或细胞。,(totipotency)：一个生活细胞具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性（植物组织培养的理论基础）生物体内的细胞为什么没有表现出全能性？而是发育成各种组织器官？基因在特点的时间和空间条件下选择性表达的结果。在什么条件下植物细胞表现出全能性？离体条件下，在一定的营养物质、激素和环境条件下。,植物细胞全能性,脱分化(dedifferentiation)：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。去分化(redifferentiation)：离体培养的植物组织和细胞形成的处于脱分化状态的细胞（愈伤组织），

3、再度分化成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整植株的过程。,1,2,3,二、植物组织培养的分类,培养方式 培养过程 培养材料,1.根据培养方式固体培养（Solid culture）液体培养（Liquid culture）液体培养又有液体悬浮培养与静置培养之分。固液培养（Solid-liquid culture）看护培养（Nurse culture）饲喂层培养(Feeder layer culture)微室培养(Microchamber culture),最常用的是固体培养和液体培养，它们相比，各自的优缺点表现为：固体培养优点：通气性较好，若有污染，只污染局部缺点：使培养材料与

4、培养基接触不充分，有毒物质易积累。,液体培养优点：有利于培养材料与培养基充分接触且有毒物质不易积累。缺点：一旦污染，则材料全部污染，且通气性不好。,主要用于花粉培养和单细胞培养,看护培养：是指在一个锥形瓶中，先加入一定体积的固体培养基，在其上放一块几毫米大小的愈伤组织块，再在其上放一张无菌滤纸并让其充分吸收从愈伤组织里渗透出来的培养基成分，然后将已分离好的单细胞接种到滤纸表面进行培养。,饲喂层培养：即作饲喂层的细胞经射线照射后，核失活但细胞存活，再将这种细胞用平板技术制成一琼脂(糖)平板，即饲喂层，然后将离体单细胞以液体浅层或平板技术铺在饲喂层上进行培养。,主要用于单细胞培养,微室培养：是用条

5、件培养代替看护培养，将细胞置于微室中进行培养的一种方法。显著优点：可以连续进行显微观察。主要用于花粉培养、单细胞培养和原生质体培养。,2 根据培养过程,初代培养(Primary culture)从活体植株上切取下来进行的第一次培养。继代培养（Subculture）经过初代培养的材料，转移到新鲜培养基上进行培养的过程。,3.根据培养材料(外植体),组织培养器官培养胚胎培养细胞培养 原生质体培养,（1）组织培养（Callus culture）,（2）器官培养（Organ culture）,包括根、茎、叶、花器官及其原基的培养(含根、茎段和花药等)。,(3)胚胎培养（Embryo culture）,

6、主要是对较小且未成熟的胚进行培养，研究胚胎的发生及影响胚生长的因素，特别是所需有机营养成分的研究。,（4）细胞培养（Cell culture）,离体细胞或细胞团的培养，可应用于生产某些有用成分和次生物质，单细胞培养还可用于取得单细胞无性系，进行突变体的筛选。,（5）原生质体培养（Protoplast culture）,原生质体培养是对去除细胞壁的裸露的细胞进行培养，由于其易于摄取外来遗传物质、细胞器及病毒、细菌等，所以可用于体细胞杂交或外援基因的导入研究。,组织培养的奠基人,1934年美国的White，利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，发现B族维生素对培养的离体根生长具有重要作用。创

7、立了White培养基。,1943年White发表了植物组织培养手册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。,3.细胞全能性的证实阶段（1940-1959）,1948 年，Skoog和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，确定了腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。,F.Skoog,1952-1953年：美国科学家Steward F.C.用胡萝卜根的细胞悬浮培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植抹。证实了植物细胞全能性学说。1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体

8、培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一个烟草体细胞，单细胞培养成功。,1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，首次获得植株再生成功。使细胞全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。,1956年Miller等发现了激动素。控制器官分化的激素模式变为激动素生长素的比例关系。大大促进了组培发展。,4 组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）,Edward C.Cocking,1960年，Cocking 等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。这是植物组织培养的第二次突破。,1960年G.Morel采用兰

9、花的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。这是经过茎尖原球茎小植株的方式而再生的。,G.Morel,Morel提出的这种离体无性繁殖方法，其繁殖系数极高，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。植物离体微繁技术及脱毒技术得到了迅速发展，实现了产业化。,1962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。,1964年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。,5.组织培养在生产上广泛应用阶段（1980年-今）,植物快速繁殖技术和规模化生产脱毒苗的生产体细胞胚胎发生和人工种子组织细胞培养物的超低温保存及种

10、质库的建立生产其他生物制品培养转基因植株应用于育种(单倍体培育、远缘杂交、体细胞无性系变异等),四、植物组织培养技术的发展,培养的材料范围逐渐扩大 器官 组织 细胞 原生质体 低等植物 高等植物,培养方法的逐渐改善 液体 液体振荡培养 液体悬浮培养 固体培养 看护培养 饲喂层培养 微室培养 小量 大量 试管 大罐 手工 自动化,培养基逐渐改善 White培养基、MS培养基、MT培养基等.此外，现在各种培养基配方都以成品的方式出售。,实验手段的不断完善 新型显微镜的发现 新型倍性分析仪器的发现,思考与练习,1.概念：植物组织培养、外植体、细胞全能性、脱分化、再分化2.植物组织培养的分类？3.实现

11、细胞全能性的条件是什么？4.为什么植物的花瓣在植物体内没有能发育成完整植株，而在离体条件下能发育成完整的植株呢？细胞失去了全能性 细胞中的基因部分丢失 细胞中的基因进行选择性表达 细胞中的基因变异不同,5、下列属于组织培养的是（）A.花药离体培养成单倍体植株B.芽发育成枝条C.根尖分生区发育成成熟区D.利用桑枝条扦插大田并发育成完整植株,第二节 植物组织培养实验室的设计,空间大小及装备程度取决于实验室的功用、材料及人员规模和可周转的资金，同时也应兼顾长远规划。,总体思路,洗涤室：容器、器皿及用品、用具的清洗、烘干、存放及蒸馏水的制备。培养基制备室：培养基母液的配制，培养基的制备、灭菌和贮存。接

12、种室：无菌操作室。培养室：可控温、光培养室。观察室：对培养材料进行观察、记录。炼苗室：移栽苗床等。,一个标准的组织培养实验室,一个组织培养实验室所必需具备的设施,准备室 制备室 接种室 培养室,1准备室,功能 各种器皿和器械的清洗、干燥、高压灭菌、蒸馏水制备及清洁器皿和用具的存放，同时进行试验废物、培养材料残余物的处理等工作。主 要 设 备 高压灭菌锅；蒸馏水发生器；干燥箱；洗涤用水槽。,准备室用电、用水量较大，应注意配备比较安全、专用的电源插座、电源闸刀，保持进出水道通畅。,功能：配制培养基母液及培养基的制备。普通冰箱：天平：微波炉或电炉：用于融化培养基；半导体酸度测定仪或其他pH计等；电热

13、磁搅拌器：用于溶解药品；分装培养基的器具(又叫下口杯)，大规模生产实验室可采用液体自动定量灌注设备。,2制备室,冰箱,贮存易变质、易分解的药品、培养基母液与激素；种质保存研究用。,天 平称取大量元素、微量元素以及琼脂、蔗糖等。,酸度计,测定培养基及酶制剂的pH值,功能：进行无菌操作，如材料的消毒接种，无菌材料的继代等。,3无菌操作室（接种室）,超净工作台的工作原理：内装有一个小电动机，它带动风扇鼓动空气，空气先穿过一个粗过滤器，在那里把大的尘埃滤掉，进而再穿过一个称为高效过滤器的细过滤器，把大于0.3m的颗粒滤掉，这种不带细菌和真菌的超净空气吹过整个工作区域。由高效过滤器吹出的空气速度大约是2

14、73m/min。,接种器械灭菌器,过滤灭菌器,4培养室,培养室是离体材料的培育室、生长室，主要是通过控温、控光和控湿促使离体材料分化、生长。基本设备培养架、培养箱、摇床自动时控器或手动开关灯装置 控制光照时间。控温设备空调机。,培养架 每层培养架上或安装平板玻璃，或安装钢硬的铁丝网，以使顶层的灯光能透射到下面。,培养架的规格 一般设5层，最低一层离地高约10cm，其他每层间隔3035cm，培养架高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长I3m，30W的长lm,摇床,5移栽大棚,对移栽大棚的基本要求是：地面硬化，为防止人员活动对移栽苗木的影响，放置移栽容器的地

15、方最好适当抬高。有防晒、防雨和防虫装置。最好有加温设备，使一年四季都可移栽。有缓冲间及堆料间。,第三节 培养基,1.无机营养(Inorganic element),植物所必需的无机营养成分主要包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰、铜、锌、硼、钼及碳、氢、氧等。根据国际植物生理协会的建议：将植物所需元素的浓度以0.5 mmol/L为标准分为大量元素与微量元素。,大量元素,它包括N、S、P、Ca、Mg和K，他们在植物体内的作用有：N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时N以NO3-N和NH4-N两种形式供应。大多数培养基既含有N03-N又

16、含NH4-N。N03-N对植物生长较为有利供应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。,K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。常以KCI、KNO3等盐类提供。Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H20提供。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,微量元素,铁是一些氧化酶、细胞色素

17、氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时常用FeNa2-EDTA，或将FeSO47H20和Na2-EDTA熬合使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,2.有机化合物(organic compound),糖类 维生素类 氨基酸类,糖 类 糖是组培材料必不可少的碳源和能源，此外糖类的添加还有调节培养基的渗透压的功能。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖、果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等在组织培养中也有应用。通常蔗糖的使用浓

18、度为1050g/L，常用30g/L，即配制一升培养基称取30g蔗糖。不同糖类对生长的影响不同。因此，我们应该根据实验材料和研究目的选择不同的糖类。,维生素类(vitamin),这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上明显不足，通常需加入一至数种维生素。组培中常用的维生素类主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.1-1.0mgL。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB

19、6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,此外，肌醇又叫环己六醇也是常用的有机营养成分之一。它能促进愈伤组织的形成和不定胚、不定芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,氨基酸 氨基酸是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用，对外植体的生长和不定芽、不定胚的生长具有明显的促进作用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也有使用。其用量一般为13mg/L。,此外，水解乳蛋白（CH）和水解酪蛋白（LH）、玉米胚乳、麦芽浸出物、椰子汁等，对胚状体的形成有良好的促进作用。但由于其

20、有效成分的质量和数量受产地、季节和生长环境等的影响，所以一般不用。,3.激 素(hormone),在培养基中，激素是一种关键性的物质，对植物组织培养起着决定性作用，它能以极微小的量影响到植物生长、发育和形态分化。,激素,生长素,细胞分裂素,赤霉素,生长素类(Auxin)在组织培养中的作用有：促进细胞分裂、伸长生长;诱导根的分化;与细胞分裂素结合诱导愈伤组织形成。,IAA(吲哚乙酸)是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)：在组织培养中的起动能力比IAA高3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分

21、解破坏，所以应用较普遍。IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。它与NAA 广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,细胞分裂素类(Cytokinin),常见的细胞分裂素有：6BA、Kt(激动素)、ZT(玉米素)、TDZ（噻重氮苯基脲）以及2IP（2异戊烯腺嘌呤）等。在培养基中添加细胞分裂的作用：促进细胞分裂；与生长素结合，诱导愈伤组织的产生、促进不定芽和不定胚的发生，尤其是打破顶端优势、促进侧芽萌发生长

22、。,注意事项：ZT活性强，但非常昂贵，高温灭菌时容易破坏，而6-BA和KT则性能稳定，且价格便宜，ZT在某些植物中诱导不定胚的效果最好。TDZ诱导不定芽的作用较大，但也容易引起玻璃化苗的出现。,培养基中添加赤霉素的主要作用：（1）促进幼苗茎的伸长生长；（2）促进不定胚发育成小植株；（3）赤霉素和生长素还有协同作用，对形成层的分化有影响。此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,赤霉素(GA),激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着形态分化的方向。高 有利于根的形成 生长素/细胞分裂素 有利于愈伤组织的形成 低 有利

23、于芽的形成,4.凝固剂、pH和其他成分,凝固剂 培养基所必需培养基的物理状态有液体和固体两种类型。液体培养基适于细胞培养，促进细胞生物产量或代谢产物的增加。固体培养基多用于愈伤组织和试管苗等培养。固体培养基的凝胶剂有多种类型，常用的有琼脂、琼脂糖等。,是一种由海藻获得的多糖类物质，在培养过程中，它本身并不提供任何营养，一般使用的浓度是0.5-1，若浓度太高，就会导致培养基变得很硬，营养物质难于扩散到培养的组织中去。琼脂在植物组织培养中广泛的应用。但当研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂，因为目前使用的各种琼脂都含有杂质，特别是钙、镁和铜、硅等微量元素。,琼脂,是通过纯化琼脂，除去带

24、硫酸侧链的琼脂糖果胶获得。制备过程复杂，所以琼脂糖的成本远远高于琼脂。琼脂糖的凝胶强度高，一般用于单细胞或原生质体培养，使用浓度为0.4%。原生质体包埋培养中常常选择低熔点的琼脂糖作凝胶剂。,琼脂糖,在灭菌之前培养基的pH值一般都是调节到之间。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬，低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。,pH,在培养基中添加抗生素的主要目的是防止由外植体内生菌造成的污染。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡那霉素和庆大霉素等，用量一般为520mg/L。,抗生素,大部分抗生素要求过滤灭菌,在使用抗生素时应注意以下4个问题：不同抗生素能有效抑制的菌

25、种不完全相同，因此必须有针对性地对抗生素的种类进行选择；在有些情况下，单独使用无论哪一种抗生素对污染皆无效，必须几种抗生素结合使用才能取得较好的效果；当所用抗生素的浓度高到足以消除内生菌时，有些植物的生长发育往往也同时受到了抑制；在停用抗生素后，污染率往往显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。因此，总体来说在高等植物离体培养中，特别是在商业性快速繁殖中，应当尽量避免使用抗生素。,常用的培养基及特点,MS培养基 无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培

26、养，效果良好。B5培养基 含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。KM8P培养基 其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛

27、用于原生质融合的培养。,消毒,灭菌,洗涤,第四节 基本操作技术,1.洗 涤,对于新购置的玻璃器皿等应先用1的稀盐酸浸泡1夜，然后用清水洗净。对已污染的玻璃器皿须经高温高压灭菌后用洗涤剂洗净。,2.灭 菌,干热(烘烤和灼烧)湿热(蒸煮或加压蒸煮)物理方法 射线处理 超声波 微波处理 离心沉淀清洗和大量无菌水冲洗等化学方法 使用灭菌剂进行灭菌 升汞、福尔马林、双氧水、高锰酸钾、次氯酸钠及乙醇等。,容器和小器械的灭菌 干热灭菌：160-180的恒温干燥箱内保温2h。湿热灭菌（高温蒸汽灭菌）：在121 下保持1520min.培养基的灭菌 高温蒸汽灭菌法：在121 下，根据培养基的体积确定灭菌时间。过滤

28、灭菌法：当培养基中含有易分解或变性的物质时，可采用此法。与高温蒸汽灭菌相比，有时效果不够好，但可以确保有机添加物不被破坏。,培养基在高压灭菌中或灭菌后，可能发生的变化？,灭菌后培养基的pH值会降低0.30.5；灭菌中较高的温度可使糖焦化而产生毒性；使用高压灭菌器能使挥发性物质遭受破坏；高压灭菌的时间过长会造成盐沉淀，使琼脂多聚体解聚；要注意应用正确的灭菌时间和温度。,3.植物材料的表面消毒,表1 常用消毒剂的使用浓度和效果 化 合 物 浓度范围/%处理时间/min 清除程度 备 注 次氯酸钠 11.4 530+非常有效 次氯酸钙 910 530+非常有效 过氧化氢 1012 515+有效 溴水

29、 12 210+非常有效 硝酸银 l 530+有效 氯化汞 0011 210+满意 抗生素 450mgL 3060+有效具体的化学消毒剂种类、浓度和处理时间的确定应经实验确定。,为了使植物的所有表面触到消毒液，植物材料可在70的乙醇中浸泡30s，或者在化学消毒剂中加入几滴液体去污剂(如Teepol、Tween 20)，以保证消毒效果。经过消毒剂处理后的外植体必须用无菌水反复冲洗，因为滞留在外植体中的有害化学物质会严重影响外植体的生长。外植体的消毒,思考题,1一个普通组培实验室所必需有的设施及其基本设 备有哪些？2植物组织培养的培养基由哪些成分组成？3植物器官分化的激素调控模式？4请说出常见几种培养基的特点。,END!,