植物组织培养概述.ppt

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1、第一章 植物组织培养概述,一、植物组织培养的概念二、植物组织培养的发展历史三、组织培养的应用 四、植物组织培养的发展前景,一、植物组织培养的概念,1组织培养的定义 植物离体培养（Plant in vitro culture）是指通过无菌操作，把植物体的各类结构材料，即外植体（Explant）,接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下，进行离体培养的一套技术与方法，通常称之为植物组织培养（Plant tissue culture），或植物的细胞与组织培养。,2.组织培养的原理 组织培养是建立在植物细胞全能性学说的理论基础上，所谓全能性，就是说，任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一

2、个完整植株所必需的全部遗传信息。,当然，全能性只是一种可能性，要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使这部分细胞处于离体的条件下；二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。,一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历上面所说的两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。在大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的，但在有些情况下，再分化可以直接发生在脱分化的细胞当中，其间不需要插入一个愈伤组织阶段，比如烟草的薄层表皮细胞在离体培养中就能不经愈伤组织直接分化出芽来。,

3、3组织培养的种类 根据培养培养基的不同可以将组织培养分为固体培养和液体培养；根据外植体的不同可以将组织培养分为器官培养、胚胎培养和组织培养。,(1)根据培养基及其培养方式，可以将植物组织培养区分为：固体培养:也叫琼脂培养。液体培养:液体培养又可分为振荡培养、旋转培养、静止培养等。液体培养基中放入滤纸，再将外值体置于滤纸上进行的培养称为纸桥培养。,（2）按植物不同结构材料(外植体),将离体培养技术体系分为：器官培养及器官原基培养，包括根、茎、叶、花器官及其原基的培养（含根、茎段和花药等）；胚胎培养及以胚胎为基础的培养技术，包括原胚和成熟胚培养，胚乳培养，胚珠或子房培养等；组织培养，包括分生组织、

4、形成层组织或其他组织结构（含愈伤组织）的培养。,4组织培养的主要内容 愈伤组织培养；器官培养；细胞培养；原生质体培养。,（1）愈伤组织培养：,所谓愈伤组织，原是指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体（由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官）长出来的一团无序生长的薄壁细胞。愈伤组织培养所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株，此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。,（2）器官培养：,主要指根端、茎尖、叶以及未成熟果实等的培养。茎尖培养具

5、有快速繁殖和脱除病毒的作用。,（3）细胞培养：,分散性的离体细胞或细胞团的悬浮培养，可用于生产，提取某些有用成分和次生物质。单细胞培养还可获得单细胞无性系，进行突变体选育。,（4）原生质体培养：,将去除细胞壁的裸露植物细胞进行离体培养，主要用于遗传操作。,5脱分化（Differentiation）在组织培养中，当我们把分化组织中的不分裂的静止细胞，放在一种能促进细胞增殖的培养基上以后，细胞内就会发生某些变化，从而使细胞进入分裂状态。一个成熟细胞转变为分生状态的过程叫做脱分化。,6再分化（植株再生方式）脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式：器官发生方式和胚胎发生方式。,(1)器官发生方

6、式:,其中茎芽和根是在愈伤组织的不同部位分别独立形成的，形成的时间可能也不一致，它们为单极性结构，里面各有维管束与愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间并没有共同的维管束把二者连在一起；,(2)胚胎发生方式:,即在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，或称体细胞胚，它们经历的发育阶段与合子胚相似，成熟胚状体的结构也与合子胚相同。胚状体是双极性的，有共同的维管束贯穿两极，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。,二、植物组织培养的发展历史,虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近30年来的事，但它的整个历史可以追溯到上世纪末和本世纪初。从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：,1探索阶段（20

7、世纪初至30年代中）1902年，Haberlandt（德国植物生理学家）首次进行离体细胞实验，发表了“植物离体细胞培养实验”报告；1904年，Haunts在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。1922年，Robbins（美国）和Kotte（德国）分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。1925年，Laibach把由亚麻种子和杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；,2奠基阶段（30年代中至50年代末）1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，第一次器

8、官培养；起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来（1937），他用3种B族维生素，即毗哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。在这个以后被称为White培养基的合成培养基上，他把某些干1934年建立起来的根培养物一直保存到1968年他逝世前不久。,1934年，Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织培养中发现，虽然在含有葡萄糖的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。由于这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了同年，White由烟草种间杂种的瘤组织1939年，G

9、autheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功；1934年，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物；因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。,50年代开始以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展就有以下6项：1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。,19531954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。方法是把万寿菊（Tagetes erecta）和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，使组织破碎，形成由单细胞和

10、细胞聚集体组成的细胞悬浮液，然后通过继代培养进行繁殖。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎这种“看护培养”技术揭示了实现Haberlandt培养单细胞这一设想的可能性。,1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。现在，具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素（cytokinin）。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟分化的组织（如叶肉和干种子胚乳）的细胞进行分裂。,1957年，Skoog和 Miller提出了关于植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是

11、生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。,1958年，Wickson和 Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的胞芽的生长。这意味着，当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，可使侧芽解除休眠状态，且能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些存

12、于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转移到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。后来，Murashige发展了这一方法，制订了一系列标准程序，把这一方法广泛用于到花卉和果树的快速繁殖上。,19581959年，Reinert和 Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物如胡萝卜

13、和毛奖中，事实上由植物体的任何部分都可以得到体细胞胚。,综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，为以后的发展奠定了基础。,3迅速发展阶段（60年代至现在）据罗土韦统计，在60年代初期，全世界还只有十几个国家的少数实验室从事组织培养研究，但到了70年代，组织培养领域仍然空白的国家已经屈指可数。60年代以来组织培养技术所以得到了迅速发展，一方面是由于有了前60年建立的理论和技术基础；另一方面是由于这项技术开始走出了植物学家和植物生理学家的实

14、验室，通过与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，在植物改良中发挥了重要的作用，并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。60年代以来组织培养技术的发展，概括起来可以分为三个方面：,（1）原生质体培养取得重大突破 1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功，激发了人们对原生质体培养的热情。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。最近几年间，水稻、玉米、小麦、高粱、谷子和大麦等的原生质体培养才相继告捷。原生质体培养的成功，

15、促进了体细胞融合技术的发展。1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。后来在有性亲合及有性不亲合的亲本之间，又获得了若干其他的体细胞杂种。,（2）花药培养取得显著成绩 1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小抱子直接发育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到160余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目

16、的成就。,（3）微繁技术得到广泛应用 1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”，目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草萄等）中，微繁也已达到了工厂化的生产规模，在若干作物中与通过茎尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。,在整个组织培养发展的历史中，我国学者曾经做出过多方面的贡献。除了前面提到过的崔墩的工作以外，1933年李继侗等关于银杏胚胎培养的工作，19351942年间罗宗洛等关于玉米等植物离体根尖培养的工作，以及后

17、来罗主韦关于幼胚和茎尖培养的工作，李正理等关于离体胚培养中形态发生及离体茎尖培养的工作，王伏雄等关于幼胚培养的工作等，都是组织培养各有关领域里的有价值的文献。70年代以来，我国组织培养研究出现了新的局面，发展速度较快，在某些方面已经做出了举世公认的重要成绩，尤其是在花药培养和原生质体培养方面，我国学者的工作已经受到世界各国同行的普遍重视和赞赏。,从上述组织培养发展简史我们可以看到，象任何其他科学领域一样，组织培养在开始时也只是一种纯学术性的研究，用以回答有关植物生长和发育的某些理论问题。但其发展的结果，却显示出巨大的应用价值，某些技术已经在农业生产中直接或间接地产生了显著的经济效益，并且肯定将

18、会产生更大的经济效益。,三、组织培养的应用（Tissue Culture Applications）1用组织培养技术快速繁殖优良种苗，生产“人工种子”；2.用茎尖分生组织培养结合热处理脱除病毒；3.用花粉培养培育遗传上纯合的优良新品种；4.用植物试管受精或胚胎培养获得种间或属间远缘杂种；,5.用细胞融合技术生产植物体细胞杂种和病害检测用的单克隆抗体；6.用植物悬浮细胞和固定化细胞技术生产有用的次生代谢产物；7.用液氮冷冻植物组织或细胞，保存种质资源。,四、植物组织培养的发展前景 目前我国共有较大型的植物组培快繁企业 50 多家,主要繁殖花卉、果树和经济树木的良种苗木。但年生产能力多在100 万

19、株以下,且 90%以上的企业实际处于亏损状态。其中的主要问题有两个:一是生产规模太小,二是生产成本太高。这 两个问题是相互联系的。只有通过扩大规模,降低成本,才能 充分发挥这种高新技术在现代植物生产和农业产业化中的重要作用。植物组织培养技术的发展主要体现在以下三个方面:,1组培容器的大型化 目前大量使用的是玻璃或耐高温塑料制成的三角瓶、罐头瓶,最大体积不超过 500 毫升。通过模拟植物在微生态条件下的气体交换、营养吸收、形态建成,计算植物微群落生长的最佳空间形状与大小,依此改进容器形态,扩大体积,增加单位 培养面积中组培苗的数量。同时改良封口材料,以达到优质(通气隔菌)、方便、耐久的目的。,2

20、.组培技术的简单化 这里主要是指免转接一步成苗。培养基的配制与组培材料的转接是植物组培快繁的两大主要日常工作,而实际上植物的正常生长只需水分、矿质营养、空气等，并不需要经常移植。经常移植还会对植物的生活力造成一定的影响。在培养基成分分析与植物营养分析的基础 可通过培养容器中水分、矿质、激素和气体的交换与调整,实现免转接一步成苗。这其中包括组培苗根原基的诱导与瓶外生根。,3.组培环境的自然化 除培养基原料和人工费之外,目前组培快繁企业的最大支 出是能源费。某些地方实行的自然光照培养,虽然减少了照明用电,但却极大地增加了夏季降温和冬季加温的能源费。二者相比,得不偿失。通过对光、温、气的综合调控,可

21、达到恒温、恒光、恒湿、无菌的低成本运行。,就组织培养在植物生产中的应用研究来看,如果说 20 世 纪 80 年代初、中期是我国植物组织培养的研究工作的高潮,那么到了90年代末期,我国植物组织培养已经迎来了第二个高潮,即组织培养技术应用的高潮。随着我国农村产业结构的调整,植物组织培养技术作为最具应用价值的农业高新技术,受到了广泛的重视。各级政府、国有企业和私有企业都在应用组培技术从事花卉、果树或经济林木的脱毒、快繁。组织培养从研究到生产,必须经过中间试验阶段,而这往往成为限制组培产业化的瓶颈。因此,生产单位必须加强与科研单位的协作,科研单位也要与生产实践相结合,共同推动我国组培产业化的进展。,思考题1、基本概念：组织培养；愈伤组织；外植体；脱分化；再分化2、植物组织培养有哪些应用？3、植物组织培养的发展前景如何？,